染色(se)體(ti)非整(zheng)倍體(ti)是導致自然流(liu)產(chan)和體(ti)外(wai)受精中胚胎移植失敗的主要(yao)原(yuan)因，其發生(sheng)率與母(mu)體(ti)年(nian)齡密切相(xiang)關。對(dui)有生(sheng)育需求的高(gao)齡女性(xing)進行(xing)PGT-A檢測，篩選整(zheng)倍體(ti)胚胎移植，能夠有效降低流(liu)產(chan)率，提高(gao)妊娠率和活產(chan)率。

極體（Polar body，PB）活檢、卵裂期胚胎活檢以及囊胚期滋養層細胞活檢是PGT取材的主要方法。與另外兩種方法相比，極體活檢具有對胚胎損傷小、倫理上易被接受、胚胎利用率高以及能夠實現新鮮胚移植等特點[1]。但既往(wang)研究發現，極體活檢的(de)PGT-A在大多數(shu)臨床環境(jing)中不具(ju)有(you)成本效益。隨著(zhu)納米孔測序技術(shu)的(de)快速發展，測序質量的(de)顯著(zhu)提高(gao)，基于此的(de)極體PGT-A將(jiang)會成為未來的(de)首選嗎？

 

近期，《Clinical Chemistry》（IF=9.300）和《Journal of Assisted Reproduction and Genetics》（IF=3.100）先(xian)后發表了題為“Evaluation of Nanopore Sequencing on Polar Bodies for Routine Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy”、“Aneuploidy detection in pooled polar bodies using rapid nanopore sequencing”的兩(liang)篇(pian)文章，深入探討了基于納(na)米(mi)孔測序技術的(de)極體(ti)非整(zheng)倍體(ti)檢測在(zai)臨床中的(de)應用價值，快(kuai)來一睹為(wei)快(kuai)吧(ba)！

 

PART 01

納入20例患者的102份混合PB樣本，比較基于常規aCGH以及基于納米孔測序的PGT-A檢測結果[2]。研究設(she)計如圖1所示，納米孔測(ce)序(xu)工(gong)作流程如圖2所示。

圖1：研(yan)究設計（包括研(yan)究中(zhong)發現的一致性）。PGT-A：胚胎植入(ru)前(qian)非整倍體遺傳學檢測(ce)；aCGH：微陣列比較基因組雜交；PPV：陽(yang)性預測(ce)值；NPV：陰性預測(ce)值。

圖2：納(na)米孔測(ce)序(xu)工(gong)作(zuo)(zuo)流程(cheng)的(de)示意圖概述，包括(kuo)嵌入臨床PGT-A工(gong)作(zuo)(zuo)流程(cheng)中(zhong)的(de)各個(ge)操作(zuo)(zuo)的(de)時間測(ce)量(liang)。根(gen)據6個(ge)混(hun)合樣本的(de)中(zhong)位測(ce)序(xu)時間計(ji)算(suan)每(mei)個(ge)樣本的(de)比例測(ce)序(xu)時間。ICSI：卵胞質內單精子注射(she)；PB1：第一極(ji)體；PB2：第二極(ji)體：WGA：全基因組(zu)擴增(zeng)。

 

納米孔測序與常規aCGH分析的比較

共有(you)99個樣本質量合(he)格，被納入分析。
01 共(gong)99個混合PB樣本用(yong)于(yu)PGT-A檢測（aCGH與ONT的比(bi)較）（圖2）。其中，aCGH檢出整倍(bei)體29個（29.3%），非(fei)整倍(bei)體70個（70.7%）。納(na)米孔測序檢出整倍(bei)體32個和(he)非(fei)整倍(bei)體67個，樣(yang)本水平一(yi)致性(xing)(xing)為(wei)(wei)97.0%，靈(ling)敏度為(wei)(wei)0.957，特異性(xing)(xing)為(wei)(wei)1.0，陽性(xing)(xing)預(yu)測(ce)值(zhi)（PPV）為(wei)(wei)1.0，陰(yin)性(xing)(xing)預(yu)測(ce)值(zhi)（NPV）為(wei)(wei)0.906（圖(tu)1）。
02 所有aCGH和ONT分析的結果列在表1中。3例aCGH檢測為非整倍體的樣本經納米孔測序檢測為整倍體。
03 在99例樣(yang)本中(zhong)，aCGH分析共檢(jian)出195條(tiao)非(fei)整倍體(ti)染(ran)色(se)體(ti)，其中(zhong)98條(tiao)為(wei)三體(ti)，97條(tiao)為(wei)單體(ti)，覆蓋23對染(ran)色(se)體(ti)。在(zai)(zai)aCGH和/或ONT中發現的所(suo)有受累染(ran)(ran)色體如(ru)圖(tu)3所(suo)示。在(zai)(zai)染(ran)(ran)色體水平發現98.7%的一致性（2,273條(tiao)染色(se)體中(zhong)的2,243條(tiao)被一致鑒定為(wei)正常或異常），敏感度為(wei)0.896，特(te)異性為(wei)0.995，陽性預測值為(wei)0.940，陰(yin)性預測值為(wei)0.990。
04 通過納(na)米(mi)孔(kong)測序后的(de)生(sheng)(sheng)物信(xin)息學數據(ju)分析流水線自動(dong)生(sheng)(sheng)成(cheng)的(de)整(zheng)倍體和非整(zheng)倍體檢(jian)測樣本的(de)實例染色(se)體分布圖如圖4所示。

圖(tu)3：99例(li)混合(he)樣本中(zhong)整條染色(se)(se)體(ti)(ti)非(fei)(fei)整倍體(ti)(ti)的發生。TP表(biao)示(shi)(shi)(shi)在兩(liang)種方法中(zhong)都被檢測到為非(fei)(fei)整倍體(ti)(ti)的染色(se)(se)體(ti)(ti)（TP重復或(huo)TP缺(que)失(shi)）；FP表(biao)示(shi)(shi)(shi)aCGH正常(chang)(chang)而ONT異(yi)常(chang)(chang)的染色(se)(se)體(ti)(ti)（FP重復或(huo)FP缺(que)失(shi)）；FN表(biao)示(shi)(shi)(shi)aCGH異(yi)常(chang)(chang)（FN重復或(huo)FN缺(que)失(shi)）而ONT正常(chang)(chang)的染色(se)(se)體(ti)(ti)。“真陰(yin)性”（兩(liang)種方法中(zhong)的正常(chang)(chang)染色(se)(se)體(ti)(ti)）不顯(xian)示(shi)(shi)(shi)。縮寫：TP，真陽性；FN，假陰(yin)性；FP，假陽性。

圖4：自(zi)動生成的納米孔(kong)測序工作(zuo)流程中的染(ran)色體分(fen)布(bu)圖。對每(mei)個染(ran)色體的質量值噪聲和(he)(he)MAPD進(jin)行(xing)了(le)映射，并突(tu)出顯示了(le)總樣(yang)本的閾值（分(fen)別為(wei)0.6和(he)(he)1.7）。縮寫(xie)：MAPD：所有兩(liang)兩(liang)差(cha)異(yi)絕對值的中位數；噪聲，每(mei)段內標準(zhun)化閱(yue)讀計數的中位數標準(zhun)偏(pian)差(cha)。

 

表1：ONT與aCGH檢測結果比較

 

核酸內切酶消化

評估核酸內切酶消化步驟的重要性。雖然高信噪比的樣本顯示出匹配結果，但額外的消化明顯降低了噪聲，并提高了對具有挑戰性的案例的CALL出。

 

時間和經濟成本效益

01 ONT工作流程在1.5h內可完成一個樣本的測(ce)序（從擴(kuo)增的DNA到倍性結果），大約(yue)12小時內可完成12個(ge)樣(yang)品(pin)的分析，具有更快(kuai)的處(chu)理速度(du)。此(ci)外，ONT方法的(de)(de)優勢在于(yu)其動態分辨率的(de)(de)調整能(neng)力(li)，這(zhe)(zhe)使得它能(neng)夠更靈活地生成針對含有三個染(ran)色體(ti)拷貝的(de)(de)極體(ti)樣本的(de)(de)詳細報告，這(zhe)(zhe)是傳(chuan)統aCGH方法所不具備的(de)(de)。
02 整(zheng)個工作流(liu)程的材料成本，包括WGA、樣品(pin)制備(bei)、測序(xu)和數據分析，每(mei)個樣品從110美元到240美元（100歐(ou)元到220歐(ou)元）不等。

 

PART 02

納入102個混合PB樣(yang)本，比較基于常規aCGH以及基于納米孔測序的PGT-A檢測結果[3]。兩(liang)種方法工(gong)作(zuo)流(liu)程示意圖，如(ru)圖1。

圖(tu)1：兩種方法的(de)工(gong)作流程示意圖(tu)：微陣列比(bi)較(jiao)基(ji)因(yin)組雜交（aCGH）和(he)(he)牛津納米(mi)孔技術(shu)（ONT）。這兩種技術(shu)的(de)初始步(bu)驟都是(shi)(shi)極體活檢和(he)(he)全基(ji)因(yin)組擴(kuo)增（WGA），然后是(shi)(shi)特異(yi)性文庫的(de)制備和(he)(he)倍性分類和(he)(he)拷(kao)貝數(shu)變(bian)異(yi)（CNV）分析(xi)。

圖2：比(bi)較兩個(ge)樣本的(de)(de)aCGH和(he)ONT倍性(xing)分析。根據(ju)aCGH的(de)(de)平(ping)均(jun)log2比(bi)值閾值進(jin)行(xing)的(de)(de)倍性(xing)分類(lei)，以及報告的(de)(de)臨床評(ping)估或利用ONT進(jin)行(xing)的(de)(de)計(ji)(ji)(ji)算(suan)機倍體分類(lei)。（a）使(shi)用aCGH對CNV狀(zhuang)態進(jin)行(xing)全(quan)基因組分析。（b）使(shi)用aCGH檢測(ce)每條(tiao)(tiao)染色(se)(se)體的(de)(de)平(ping)均(jun)log2比(bi)值（WGA擴增的(de)(de)樣本與對照(zhao)DNA）。淺灰色(se)(se)條(tiao)(tiao)表示(shi)(shi)(shi)與雄鼠對照(zhao)的(de)(de)信(xin)號分布，深(shen)灰色(se)(se)條(tiao)(tiao)表示(shi)(shi)(shi)與雌鼠對照(zhao)的(de)(de)信(xin)號分布。匯集極(ji)體的(de)(de)重復（橙色(se)(se)線(xian)(xian)表示(shi)(shi)(shi)）和(he)缺失（藍(lan)色(se)(se)線(xian)(xian)表示(shi)(shi)(shi)）的(de)(de)閾值。（c）使(shi)用ONT進(jin)行(xing)全(quan)基因組CNV分析。黑點表示(shi)(shi)(shi)大約1 Mb的(de)(de)每個(ge)可變寬度bin的(de)(de)總讀(du)(du)計(ji)(ji)(ji)數(shu)(shu)。黃(huang)色(se)(se)線(xian)(xian)表示(shi)(shi)(shi)重復，紫色(se)(se)線(xian)(xian)表示(shi)(shi)(shi)缺失。（d）使(shi)用ONT繪制每條(tiao)(tiao)染色(se)(se)體的(de)(de)裝箱(xiang)讀(du)(du)片(pian)計(ji)(ji)(ji)數(shu)(shu)箱(xiang)線(xian)(xian)圖。彩(cai)色(se)(se)線(xian)(xian)顯示(shi)(shi)(shi)預期(qi)讀(du)(du)取計(ji)(ji)(ji)數(shu)(shu)。黃(huang)色(se)(se)線(xian)(xian)表示(shi)(shi)(shi)重復的(de)(de)預期(qi)讀(du)(du)取計(ji)(ji)(ji)數(shu)(shu)，紫色(se)(se)線(xian)(xian)表示(shi)(shi)(shi)缺失的(de)(de)預期(qi)讀(du)(du)取計(ji)(ji)(ji)數(shu)(shu)。

 

 

非整倍體檢測—ONT vs. aCGH

01 整個(ge)基因組的(de)信(xin)號模式(shi)在視覺上相似，每條染色體的(de)平均值也相近（圖2）。
02 96%（98/102）的樣本的倍性檢測結果（整倍體、非整倍體）一致。4個(ge)(ge)不一致樣(yang)本(ben)（ID023、ID028、ID062、ID072），aCGH歸(gui)類為整倍體，而ONT歸(gui)類為非整倍體（表1）。而最(zui)終臨床評估(gu)(gu)顯(xian)示，只有(you)兩個(ge)(ge)樣(yang)本(ben)（ID023和(he)ID062）的結(jie)果(guo)與ONT不同，另外(wai)兩個(ge)(ge)樣(yang)本(ben)（ID006和(he)ID063）的臨床評估(gu)(gu)為不確定(ding)。

表1：兩種方法倍性分類的樣本數交叉表

（藍色：一致；紅色：不一致）

每條染色體的非整倍性統計

01 基于aCGH分析的2,346條染色體中，92.5%（2,169/2,346）的染色體倍性分類結果與ONT一致。aCGH檢測的94.0%（47/50）染色單體重復、93.7%（2,032/21,68）整倍體和70.3%（90/128）的染色單體缺失與ONT分類的結果一致（表2）。
02 少數樣本染色體倍性分類不一致率高。大多數樣本中ONT數據的基線與aCGH數據處于不同的水平。例如，對于樣本ID016，將ONT基線與aCGH基線相比較，使差異從17條染色體減少到僅1條染色體（圖3b，d，f）。因此，排除了超過一半染色體為非整倍體的8個樣本，使用ONT進行進一步的一致性分析。除了上述8個樣本，每條染色體的一致性增加到97.7%（2113/2162）（表3）。
03 總體而言，使用ONT的非整倍體染色體數目高于aCGH（150 vs. 131）。在兩種方(fang)法中，染色(se)單體缺失(shi)的(de)總數(shu)（ONT：84，aCGH：83）均(jun)高于染色(se)單體重復的總數（ONT：66，aCGH：48）（圖4）

 

表(biao)(biao)2：兩種方(fang)法用(yong)于(yu)特定倍性(xing)分類的染色體(ti)數目交(jiao)叉(cha)表(biao)(biao)（藍色：一(yi)致(zhi)；紅色：不一(yi)致(zhi)）

 

表3：過濾高度復雜樣本后，兩種方法用于(yu)特定倍(bei)性分類的染色體數目交叉表（藍色：一致(zhi)(zhi)；紅色：不一致(zhi)(zhi)）

 

部分重復和缺失

01 ONT工作流程可自動識別樣本ID050的2號(hao)染(ran)色(se)體(ti)的50 Mb重復(fu)(fu)，樣本ID005的1號(hao)染(ran)色(se)體(ti)約13 Mb的缺失，樣本ID072的2p重復(fu)(fu)、7p缺失和Xq重復(fu)(fu)等(deng)微小(xiao)畸變(bian)。通過可視化回顧(gu)全基因組分析結果，可以(yi)在aCGH數(shu)據中(zhong)看到這些(xie)畸變(bian)（圖(tu)3a、c、e）。

圖3：片段(duan)性(xing)非整倍(bei)體(ti)檢測(ce)（ID005）和基線(xian)偏移（ID016）。對(dui)于a-d和f，上述給出了(le)使用(yong)(yong)ONT計算的(de)倍(bei)性(xing)分(fen)(fen)類，或者基于aCGH的(de)平(ping)均(jun)log2比值閾值進(jin)行的(de)倍(bei)性(xing)分(fen)(fen)類，這與報(bao)道的(de)臨床評估一致。a,b.使用(yong)(yong)aCGH對(dui)兩個(ge)樣本的(de)CNV狀態進(jin)行全基因組(zu)分(fen)(fen)析(xi)。c,d. 利用(yong)(yong)ONT進(jin)行全基因組(zu)CNV分(fen)(fen)析(xi)。黑點表(biao)示大約1 Mb的(de)每(mei)個(ge)可(ke)變寬度bin的(de)總讀計數。黃色(se)線(xian)表(biao)示重復，紫色(se)線(xian)分(fen)(fen)別(bie)表(biao)示缺失或雙倍(bei)缺失。e.上述CNV分(fen)(fen)析(xi)的(de)單染色(se)體(ti)視圖（樣本ID005）顯示1號染色(se)體(ti)的(de)部分(fen)(fen)缺失。f. 使用(yong)(yong)ONT進(jin)行全基因組(zu)CNV分(fen)(fen)析(xi)，樣本ID016的(de)數據(ju)集(ji)減少(shao)到(dao)300 k reads

 

圖4：每種方(fang)法的(de)染色體重復(fu)和缺失的(de)絕(jue)對(dui)數量，包括94個樣本(ben)（高度復(fu)雜的(de)樣本(ben)被過濾）

 

所需的讀取次數和工作流程時間

01 aCGH的工作流程大約需要24小時，包括16小時的過(guo)夜雜交步驟。ONT的工作流程可以(yi)在相似的時間內對(dui)大約1 M的讀數進行測序和分析。如果(guo)計劃進(jin)行新鮮胚胎(tai)移植，工作流程時間(jian)(jian)很重要。為了模擬更(geng)短的測序時間(jian)(jian)，將reads的數(shu)量隨機(ji)降采樣到300 k，實現了大(da)約5 h的測序時間(jian)(jian)（圖1）
02 在分析縮減后的數據集后，相對于原始ONT結果，每個樣本的倍性分類結果相等，只(zhi)有兩個(ge)(ge)樣(yang)本(ben)的21號染(ran)色體缺(que)失小于染(ran)色體長度的一半，因(yin)此預測(ce)不(bu)為缺(que)失，而在(zai)另一個(ge)(ge)樣(yang)本(ben)中，與原始結果(guo)和aCGH評(ping)估不(bu)同，使(shi)用縮減后的數(shu)據集將倍性分類分配為非整倍體。

 

總   結

• 與aCGH相比，納米孔測序具有更多的優勢，包括（但不限于）檢測快速、測序價格低廉以及所需的初始投資成本。

• ONT方法在檢測極體的染色體倍性和微重復或缺失方面展現了明顯優勢，特別是在考慮到匯集的極體中存在三個染色體的情況下。

• 相較于標準的商業aCGH方法，ONT技術能夠更準確、高效地評估染色體狀態，為PGT-A提供了一種新的、更優的檢測方案。

 

參考文獻

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