染(ran)色體非整(zheng)倍體是導致自(zi)然(ran)流產(chan)和(he)體外受精中(zhong)胚胎移植失敗的主要(yao)原因，其發(fa)生(sheng)率與母(mu)體年(nian)齡密(mi)切相關。對有(you)生(sheng)育需求的高齡女(nv)性進行PGT-A檢測，篩選整(zheng)倍體胚胎移植，能夠(gou)有(you)效降(jiang)低流產(chan)率，提高妊娠率和(he)活產(chan)率。

極體（Polar body，PB）活檢、卵裂期胚胎活檢以及囊胚期滋養層細胞活檢是PGT取材的主要方法。與另外兩種方法相比，極體活檢具有對胚胎損傷小、倫理上易被接受、胚胎利用率高以及能夠實現新鮮胚移植等特點[1]。但既往研究發現，極體活(huo)檢的(de)(de)PGT-A在大多數臨床環(huan)境(jing)中不具有成本效益。隨(sui)著納(na)米孔(kong)測(ce)(ce)序技術的(de)(de)快速(su)發展，測(ce)(ce)序質量的(de)(de)顯著提高(gao)，基于(yu)此(ci)的(de)(de)極體PGT-A將會成為(wei)未(wei)來的(de)(de)首選嗎？

近期，《Clinical Chemistry》（IF=9.300）和(he)《Journal of Assisted Reproduction and Genetics》（IF=3.100）先(xian)后(hou)發(fa)表了題為(wei)“Evaluation of Nanopore Sequencing on Polar Bodies for Routine Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy”、“Aneuploidy detection in pooled polar bodies using rapid nanopore sequencing”的兩(liang)篇文章(zhang)，深(shen)入探(tan)討了基于納(na)米孔測序技術的(de)(de)極(ji)體(ti)非整倍體(ti)檢(jian)測在臨床中的(de)(de)應(ying)用價(jia)值(zhi)，快(kuai)來一睹為快(kuai)吧！

PART 01

納入20例(li)患者的102份(fen)混合PB樣本，比較基于常規aCGH以及基于納米孔測序的PGT-A檢測結果[2]。研究設計如圖(tu)1所示(shi)，納(na)米孔測序工作流程如圖(tu)2所示(shi)。

圖1：研究設計(ji)（包括研究中發現的一致(zhi)性）。PGT-A：胚胎(tai)植入前非整倍體遺(yi)傳學檢測(ce)；aCGH：微(wei)陣列比較(jiao)基因組(zu)雜交；PPV：陽性預測(ce)值(zhi)；NPV：陰(yin)性預測(ce)值(zhi)。

圖(tu)2：納米孔測序工(gong)作流程的示意圖(tu)概述，包括嵌入臨床PGT-A工(gong)作流程中的各個(ge)操作的時(shi)間(jian)測量。根據6個(ge)混合樣本(ben)的中位測序時(shi)間(jian)計算每個(ge)樣本(ben)的比例測序時(shi)間(jian)。ICSI：卵胞(bao)質內(nei)單精子注射(she)；PB1：第(di)一(yi)極體(ti)；PB2：第(di)二極體(ti)：WGA：全基因(yin)組擴增。

納米孔測序與常規aCGH分析的比較

共有99個樣本質量合格，被納入(ru)分析。
01 共99個(ge)混合PB樣本用于PGT-A檢(jian)(jian)測（aCGH與ONT的比較）（圖2）。其中，aCGH檢(jian)(jian)出(chu)整(zheng)(zheng)(zheng)倍(bei)體(ti)(ti)29個(ge)（29.3%），非(fei)整(zheng)(zheng)(zheng)倍(bei)體(ti)(ti)70個(ge)（70.7%）。納米孔測序檢(jian)(jian)出(chu)整(zheng)(zheng)(zheng)倍(bei)體(ti)(ti)32個(ge)和(he)非(fei)整(zheng)(zheng)(zheng)倍(bei)體(ti)(ti)67個(ge)，樣本(ben)水平(ping)一致性(xing)為(wei)97.0%，靈(ling)敏度為(wei)0.957，特異性(xing)為(wei)1.0，陽性(xing)預測值（PPV）為(wei)1.0，陰性(xing)預測值（NPV）為(wei)0.906（圖(tu)1）。
02 所有aCGH和ONT分析的結果列在表1中。3例aCGH檢測為非整倍體的樣本經納米孔測序檢測為整倍體。
03 在(zai)99例樣本中(zhong)，aCGH分析共(gong)檢出195條(tiao)(tiao)非整倍體(ti)染(ran)色體(ti)，其中(zhong)98條(tiao)(tiao)為三體(ti)，97條(tiao)(tiao)為單體(ti)，覆蓋23對染(ran)色體(ti)。在aCGH和(he)/或ONT中(zhong)發(fa)現的(de)所有(you)受累(lei)染色體(ti)如圖3所示。在染色體(ti)水平發(fa)現98.7%的(de)一(yi)致性(xing)（2,273條(tiao)染(ran)色體中的2,243條(tiao)被一致鑒定為正(zheng)常(chang)或異常(chang)），敏感度為0.896，特異性為0.995，陽性預測值(zhi)為0.940，陰(yin)性預測值(zhi)為0.990。
04 通(tong)過納米孔測(ce)序后的生物(wu)信(xin)息(xi)學數據分析(xi)流水(shui)線自動生成的整倍(bei)(bei)體和(he)非整倍(bei)(bei)體檢測(ce)樣(yang)本的實例染色體分布圖(tu)如圖(tu)4所(suo)示。

圖3：99例混合樣(yang)本中(zhong)整(zheng)條染(ran)色(se)(se)(se)體(ti)(ti)非(fei)整(zheng)倍體(ti)(ti)的發生。TP表(biao)示在兩種(zhong)方法(fa)(fa)中(zhong)都被檢測(ce)到(dao)為非(fei)整(zheng)倍體(ti)(ti)的染(ran)色(se)(se)(se)體(ti)(ti)（TP重復或TP缺失）；FP表(biao)示aCGH正常(chang)而ONT異常(chang)的染(ran)色(se)(se)(se)體(ti)(ti)（FP重復或FP缺失）；FN表(biao)示aCGH異常(chang)（FN重復或FN缺失）而ONT正常(chang)的染(ran)色(se)(se)(se)體(ti)(ti)。“真陰性(xing)”（兩種(zhong)方法(fa)(fa)中(zhong)的正常(chang)染(ran)色(se)(se)(se)體(ti)(ti)）不顯示。縮寫(xie)：TP，真陽性(xing)；FN，假陰性(xing)；FP，假陽性(xing)。

圖(tu)4：自動(dong)生成的(de)(de)(de)納米孔測序(xu)工(gong)作流(liu)程中的(de)(de)(de)染(ran)色(se)體(ti)分布(bu)圖(tu)。對每個染(ran)色(se)體(ti)的(de)(de)(de)質量值噪聲和MAPD進行了映(ying)射，并突出顯示了總樣本的(de)(de)(de)閾值（分別(bie)為0.6和1.7）。縮(suo)寫：MAPD：所有兩兩差異絕對值的(de)(de)(de)中位數；噪聲，每段(duan)內標(biao)準(zhun)化閱讀計數的(de)(de)(de)中位數標(biao)準(zhun)偏差。

表1：ONT與aCGH檢測結果比較

核酸內切酶消化

評估核酸內切酶消化步驟的重要性。雖然高信噪比的樣本顯示出匹配結果，但額外的消化明顯降低了噪聲，并提高了對具有挑戰性的案例的CALL出。

時間和經濟成本效益

01 ONT工作流程在1.5h內可完成一個樣本的測序(xu)（從擴增的DNA到(dao)倍性(xing)結果），大約12小時(shi)內可(ke)完成12個樣品的(de)分(fen)析，具有更快的處(chu)理速度。此外，ONT方法的優勢在于(yu)其(qi)動態分(fen)辨率的調整能(neng)力，這(zhe)使(shi)得它能(neng)夠更靈活地生成(cheng)針對含有三(san)個染色體拷貝的極體樣本的詳細報告，這(zhe)是傳統aCGH方法所不(bu)具備的。
02 整個工(gong)作(zuo)流(liu)程的(de)材料成本(ben)，包括WGA、樣品制備、測(ce)序和數(shu)據(ju)分(fen)析，每(mei)個樣品從110美元到240美元（100歐元到220歐元）不等。

PART 02

納入102個混合(he)PB樣本，比較基于常規aCGH以及基于納米孔測序的PGT-A檢測結果[3]。兩種方法工作流程示意圖，如圖1。

圖1：兩種方法的工作(zuo)流程示意圖：微陣(zhen)列比較基因組雜交（aCGH）和(he)(he)牛津納米孔(kong)技術（ONT）。這兩種技術的初始步驟都是極體活檢(jian)和(he)(he)全(quan)基因組擴增（WGA），然后是特異性(xing)文(wen)庫的制備和(he)(he)倍性(xing)分類和(he)(he)拷貝(bei)數(shu)變(bian)異（CNV）分析。

圖(tu)2：比(bi)(bi)較兩個樣(yang)本的(de)(de)(de)aCGH和ONT倍性分(fen)析(xi)(xi)。根據(ju)aCGH的(de)(de)(de)平(ping)均log2比(bi)(bi)值(zhi)閾值(zhi)進(jin)(jin)行(xing)(xing)的(de)(de)(de)倍性分(fen)類，以及報告的(de)(de)(de)臨床評估或利用ONT進(jin)(jin)行(xing)(xing)的(de)(de)(de)計(ji)(ji)算機(ji)倍體(ti)(ti)分(fen)類。（a）使(shi)用aCGH對CNV狀態(tai)進(jin)(jin)行(xing)(xing)全(quan)基(ji)因組分(fen)析(xi)(xi)。（b）使(shi)用aCGH檢測(ce)每條(tiao)染色(se)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)平(ping)均log2比(bi)(bi)值(zhi)（WGA擴(kuo)增的(de)(de)(de)樣(yang)本與(yu)對照(zhao)DNA）。淺灰色(se)條(tiao)表(biao)示(shi)(shi)(shi)(shi)與(yu)雄鼠對照(zhao)的(de)(de)(de)信號分(fen)布，深灰色(se)條(tiao)表(biao)示(shi)(shi)(shi)(shi)與(yu)雌(ci)鼠對照(zhao)的(de)(de)(de)信號分(fen)布。匯集極體(ti)(ti)的(de)(de)(de)重(zhong)復(fu)(fu)（橙色(se)線(xian)(xian)表(biao)示(shi)(shi)(shi)(shi)）和缺(que)失(shi)(shi)（藍色(se)線(xian)(xian)表(biao)示(shi)(shi)(shi)(shi)）的(de)(de)(de)閾值(zhi)。（c）使(shi)用ONT進(jin)(jin)行(xing)(xing)全(quan)基(ji)因組CNV分(fen)析(xi)(xi)。黑點(dian)表(biao)示(shi)(shi)(shi)(shi)大約1 Mb的(de)(de)(de)每個可變(bian)寬度bin的(de)(de)(de)總讀計(ji)(ji)數(shu)(shu)。黃(huang)色(se)線(xian)(xian)表(biao)示(shi)(shi)(shi)(shi)重(zhong)復(fu)(fu)，紫(zi)色(se)線(xian)(xian)表(biao)示(shi)(shi)(shi)(shi)缺(que)失(shi)(shi)。（d）使(shi)用ONT繪制每條(tiao)染色(se)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)裝(zhuang)箱(xiang)讀片計(ji)(ji)數(shu)(shu)箱(xiang)線(xian)(xian)圖(tu)。彩色(se)線(xian)(xian)顯示(shi)(shi)(shi)(shi)預期讀取計(ji)(ji)數(shu)(shu)。黃(huang)色(se)線(xian)(xian)表(biao)示(shi)(shi)(shi)(shi)重(zhong)復(fu)(fu)的(de)(de)(de)預期讀取計(ji)(ji)數(shu)(shu)，紫(zi)色(se)線(xian)(xian)表(biao)示(shi)(shi)(shi)(shi)缺(que)失(shi)(shi)的(de)(de)(de)預期讀取計(ji)(ji)數(shu)(shu)。

非整倍體檢測—ONT vs. aCGH

01 整個基(ji)因(yin)組(zu)的信號模式在(zai)視覺上相似，每(mei)條染色體的平均值也相近（圖2）。
02 96%（98/102）的樣本的倍性檢測結果（整倍體、非整倍體）一致。4個不(bu)一致樣(yang)(yang)本（ID023、ID028、ID062、ID072），aCGH歸(gui)類為整倍體，而ONT歸(gui)類為非(fei)整倍體（表1）。而最終臨床(chuang)評(ping)估顯示，只有兩個樣(yang)(yang)本（ID023和(he)ID062）的(de)結果與ONT不(bu)同，另(ling)外兩個樣(yang)(yang)本（ID006和(he)ID063）的(de)臨床(chuang)評(ping)估為不(bu)確(que)定。

表1：兩種方法倍性分類的樣本數交叉表

（藍色：一致；紅色：不一致）

每條染色體的非整倍性統計

01 基于aCGH分析的2,346條染色體中，92.5%（2,169/2,346）的染色體倍性分類結果與ONT一致。aCGH檢測的94.0%（47/50）染色單體重復、93.7%（2,032/21,68）整倍體和70.3%（90/128）的染色單體缺失與ONT分類的結果一致（表2）。
02 少數樣本染色體倍性分類不一致率高。大多數樣本中ONT數據的基線與aCGH數據處于不同的水平。例如，對于樣本ID016，將ONT基線與aCGH基線相比較，使差異從17條染色體減少到僅1條染色體（圖3b，d，f）。因此，排除了超過一半染色體為非整倍體的8個樣本，使用ONT進行進一步的一致性分析。除了上述8個樣本，每條染色體的一致性增加到97.7%（2113/2162）（表3）。
03 總體而言(yan)，使用(yong)ONT的(de)非整倍體染色體數(shu)目高于aCGH（150 vs. 131）。在兩種方(fang)法中(zhong)，染色單體缺失的總數（ONT：84，aCGH：83）均高于(yu)染色單體重復的(de)總數（ONT：66，aCGH：48）（圖4）

表2：兩種方法用(yong)于特(te)定倍(bei)性分類的染色體數目交叉表（藍色：一致；紅色：不一致）

表3：過(guo)濾高度復雜(za)樣本后，兩種(zhong)方法用于特定(ding)倍性分類的染色體(ti)數(shu)目交叉(cha)表（藍色：一(yi)致(zhi)；紅色：不一(yi)致(zhi)）

部分重復和缺失

01 ONT工作流程可自動識別樣(yang)本(ben)ID050的2號染色(se)體(ti)的50 Mb重復，樣(yang)本(ben)ID005的1號染色(se)體(ti)約13 Mb的缺失(shi)，樣(yang)本(ben)ID072的2p重復、7p缺失(shi)和Xq重復等微小畸(ji)變。通(tong)過可視化回(hui)顧全(quan)基(ji)因組分析結(jie)果，可以(yi)在aCGH數(shu)據中看到這些畸(ji)變（圖3a、c、e）。

圖(tu)3：片段性非整倍(bei)(bei)體檢測（ID005）和(he)基線(xian)偏移（ID016）。對于a-d和(he)f，上述(shu)(shu)給出了使(shi)用(yong)ONT計算的倍(bei)(bei)性分(fen)(fen)類，或(huo)者(zhe)基于aCGH的平(ping)均log2比值閾值進(jin)行(xing)的倍(bei)(bei)性分(fen)(fen)類，這與報(bao)道的臨床評估一(yi)致。a,b.使(shi)用(yong)aCGH對兩(liang)個樣本(ben)的CNV狀態進(jin)行(xing)全基因組分(fen)(fen)析(xi)。c,d. 利用(yong)ONT進(jin)行(xing)全基因組CNV分(fen)(fen)析(xi)。黑點表(biao)示(shi)(shi)(shi)大(da)約(yue)1 Mb的每個可變(bian)寬度bin的總(zong)讀(du)計數。黃色(se)(se)線(xian)表(biao)示(shi)(shi)(shi)重(zhong)復(fu)，紫(zi)色(se)(se)線(xian)分(fen)(fen)別表(biao)示(shi)(shi)(shi)缺失(shi)或(huo)雙倍(bei)(bei)缺失(shi)。e.上述(shu)(shu)CNV分(fen)(fen)析(xi)的單(dan)染(ran)色(se)(se)體視圖(tu)（樣本(ben)ID005）顯示(shi)(shi)(shi)1號染(ran)色(se)(se)體的部分(fen)(fen)缺失(shi)。f. 使(shi)用(yong)ONT進(jin)行(xing)全基因組CNV分(fen)(fen)析(xi)，樣本(ben)ID016的數據集減少到300 k reads

圖4：每種方法的(de)染(ran)色體重復和缺失的(de)絕對數量，包(bao)括(kuo)94個樣本（高度復雜(za)的(de)樣本被過濾(lv)）

所需的讀取次數和工作流程時間

01 aCGH的(de)工(gong)作(zuo)(zuo)流程大約需要(yao)24小時，包括16小時的(de)過(guo)夜雜交步驟。ONT的(de)工(gong)作(zuo)(zuo)流程可以(yi)在相(xiang)似的(de)時間內對大約1 M的(de)讀數進行(xing)測(ce)序和分(fen)析。如果計(ji)劃進行新鮮(xian)胚胎移植，工作(zuo)流程(cheng)時(shi)間(jian)很重要(yao)。為(wei)了(le)模擬更短的(de)測序(xu)時(shi)間(jian)，將reads的(de)數量隨機降(jiang)采樣到300 k，實現了(le)大約5 h的(de)測序(xu)時(shi)間(jian)（圖1）
02 在分析縮減后的數據集后，相對于原始ONT結果，每個樣本的倍性分類結果相等，只有兩個(ge)樣本(ben)的(de)21號染色(se)體缺(que)失小(xiao)于染色(se)體長(chang)度的(de)一半，因此(ci)預測不為(wei)缺(que)失，而在另一個(ge)樣本(ben)中，與原始結果和aCGH評估不同，使用(yong)縮減后的(de)數據集將倍性分(fen)類分(fen)配(pei)為(wei)非整(zheng)倍體。

總   結

• 與aCGH相比，納米孔測序具有更多的優勢，包括（但不限于）檢測快速、測序價格低廉以及所需的初始投資成本。

• ONT方法在檢測極體的染色體倍性和微重復或缺失方面展現了明顯優勢，特別是在考慮到匯集的極體中存在三個染色體的情況下。

• 相較于標準的商業aCGH方法，ONT技術能夠更準確、高效地評估染色體狀態，為PGT-A提供了一種新的、更優的檢測方案。

參考文獻

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