摘要：Y染色體無精子癥因子（AZF）缺失檢測是診斷無精子癥和嚴重少精子癥的關鍵技術。作為2013年EAA/EMQN指南的修訂版，新版指南在回顧總結以往臨床相關進展的基礎上，對舊版指南內容進行了大量更新，并對EAA/EMQN提供的外部質量評估項目結果做出了反饋。基礎多重PCR檢測體(ti)系結合擴展性缺失分析，仍然是目前檢測和正(zheng)確(que)解釋AZF缺失的金標準。同時，對sY84引物序列進行了更新，且對AZFa和AZFb缺失斷點的可互換邊界位點也進行了改進。具體而言，新版指南(nan)不再推薦sY83和(he)sY143被用于擴展(zhan)性缺失(shi)分析，而是(shi)將sY1064和(he)sY1192作為首選位點。盡管目前有些國家AZF缺失檢測正在向注冊試劑盒化過渡，但應注意的是，許多商業產品由于包含大量不必要位點而不被推薦使用。此外，目前這些可用產品都不符合用于擴展性(xing)缺失分(fen)析(xi)的新首選位點。AZFc區域gr/gr部分缺失是精子發生障礙人群特異性危險因素，也是睪丸生殖細胞腫瘤的易感因素。但這種(zhong)缺失類型的檢測與否仍需由診(zhen)斷實驗室和送檢臨床醫生自行決定。鑒于EMQN/EAA計劃運行22年的經驗表明，參與計劃的實驗室基因型診斷錯誤率大幅下降，診斷報告質量也極大改善，強烈鼓勵AZF檢測實驗室每(mei)年參與該外部質量(liang)控制計劃。

 

Y染色體無精子癥因子（azoospermia factor，AZF）缺失是導致男性不育的第二大遺傳因素，其發生率僅次于克氏綜合征。在普通人群中，約每4000名男性中就有1人存在Y染色體微缺失，而在不育男性中其發生率更高。不同實驗室AZF微缺失發生率為2%~10%（甚至更高），主要由研究人群組成差異導致。通常，接受外部機構送檢的常規診斷實驗室在沒有控制患者選擇的情況下的發病率要低得多，通常低于(yu)2%。
已發表數據和質量控制(zhi)計(ji)(ji)劃(hua)都證實(shi)，不(bu)同實(shi)驗室(shi)(shi)采取(qu)的(de)檢測方案差異(yi)，確實(shi)會導致不(bu)準(zhun)確或完(wan)全錯(cuo)誤的(de)診斷(duan)，表明檢測標(biao)準(zhun)化(hua)和質量控制(zhi)的(de)必要性。也因此，歐洲男科學會（EAA）和分子遺傳質量協作網（EMQN CIC）聯合開始提供外(wai)部質量評估（EQA）計(ji)(ji)劃(hua)，并定期發布Y染色體微缺失分子診斷(duan)的(de)實(shi)驗室(shi)(shi)指南。

經(jing)10年(nian)數(shu)據積累(lei)，本次EAA/EMQN關于Y染(ran)色(se)體AZF微缺失(shi)分(fen)子診斷指(zhi)南(nan)作(zuo)出了大量更(geng)新(xin)，以更(geng)好服務于臨床。更(geng)新(xin)要點：
01 AZFa近端邊界位點sY83和(he)sY1064不可互換，因為它們的結果取決于檢測到的AZFa完全缺失近端斷點的變化。重要的是，AZFa完全缺(que)失可(ke)以(yi)與(yu)sY83（present）和sY1064（absent）兼容。因此，在(zai)強制擴(kuo)展性缺(que)失分析中只(zhi)推(tui)薦(jian)sY1064，而(er)不推(tui)薦(jian)sY83。
02 AZFb遠(yuan)端邊界(jie)位點sY143和sY1192不能(neng)互換，只有sY1192能夠區分AZFb完全和部(bu)分缺失（從而(er)為TESE成功與否提(ti)供可靠預后）。因此，在強(qiang)制擴展性缺(que)失分析中只推(tui)薦sY1192，而不推(tui)薦sY143。
03 對sY84的正向引物(wu)和反向引物(wu)序列進行了更新，以避免正向引物錯配，同時反向引物兼容亞洲人群的SNP。
04 AZFb缺失斷點的可變性可導致大量AZFb和AZFbc完全缺失中sY1224近端邊界位點的保留。盡管這種變異的表型尚不清楚，但建議優(you)先使用sY121，再使用sY1224（如果sY121缺失(shi)）。
05 據目前所知，擴展性缺失分析中首選(xuan)位點的變化與目前市面上任何AZF缺失分子診斷(duan)試(shi)劑盒都不完全兼容。

 

一、Y染色體微缺失遺傳學檢測的適應癥

AZF缺(que)失檢測的精液評估閾(yu)值尚(shang)未(wei)達成(cheng)共識(shi)。精子濃度<2×106/mL的無精癥或嚴重少精癥患者一般能夠發現臨床相關的缺失，而精子濃度在2~5×106/mL之間的不育患者很少有此發現。2010版《WHO人類精液檢查和處理實驗室手冊》將生精指標改為精子總數，歐(ou)洲(zhou)臨床指南現今仍然將AZF缺失(shi)檢測的(de)精(jing)(jing)子(zi)總數閾值設(she)定為＜500萬(wan)精(jing)(jing)子(zi)/mL；然而，在(zai)精(jing)(jing)子(zi)濃(nong)度>1×106/mL的(de)男性中，該(gai)檢測的(de)成本效益受到質疑。但無論如何，一致(zhi)建議對無精子癥男性(xing)進行Y染色體缺(que)失篩查(cha)，因(yin)為它不僅可以提供病因(yin)診(zhen)斷，而且可以對TESE的成功率進行可靠(kao)估計。

圖1為本指南建議的分析步驟流程圖，分為基礎檢測體系和擴展性檢測體系。常規臨床參(can)數，如激素水(shui)平、睪(gao)丸體(ti)積、精索(suo)靜脈(mo)曲(qu)張、睪(gao)丸發(fa)育不良(liang)、感染(ran)等，沒有任何預測價值(zhi)。通常，染色(se)體異常（46,XY/45,X核型除外）、梗阻性無精子癥(zheng)（除非FSH高于正(zheng)常限值）或促性腺功(gong)能減(jian)退癥(zheng)患者不需(xu)要進行Y染色(se)體分子分析。然而，在非(fei)特發性不育男性中已經發現了許多缺失攜帶者，即患有睪丸腫瘤、附睪閉塞、睪丸炎、精索靜脈曲張或化療/放療后的患者。因此，任何(he)伴有無精子癥或(huo)嚴重少精癥的診(zhen)斷都應該是(shi)AZF檢測的指征。例如，對屬于上述精液類別的男性，在精索靜脈曲張切除術前進行AZF篩查很重要，因為缺失攜帶者很可能不會從手術中受益。Klinefelter患者(zhe)檢測(ce)Y染色體缺失的臨(lin)床實用(yong)性尚未確(que)定(ding)。

圖1（A）AZF基礎檢測體系及診斷流程

 

 

圖1（B）AZF擴展性缺失檢測體系及診斷流程

 

 

二、Y染色(se)體男(nan)性特異性區域結構

Y染色體男性特異性區域（MSY）參考序列包含156個轉錄單位（其中包括78個蛋白質編碼基因，編碼27種不同的蛋白質），分為三種類型：X-退化區（X-degenerate；來自染色體祖先狀態的單拷貝基因或假基因）、X-換位區（X-transposed；從X染色體獲得，與相應的X區域99%同源）以及擴增區（ampliconic）。其中，后者對應于重復區，分為多個家族類型，每個重復區在家族內重復之間共享幾乎完全（>99.9%）的同一性。擴增區包含9個睪丸特異性或富集表達的蛋白質編碼基因家族。最初，這些家族估計至少有60個編碼基因，現在這個(ge)數字已經增加(jia)到超過100個(ge)。由于擴增區的高度重復性，既可以進行基因轉換，也可以進行非等位基因（染色體內）同源重組（NAHR）。擴增子可以沿著MSY以有序的方式排列，從而形成回文：在MSY的相當長范圍內延伸的不同擴增子重復的鏡像塊。擴增子（和回文）組織增強了結構變異的產生，如缺失、重復和倒位。普遍認為，NAHR是產生AZF完全缺失的主要驅動力。這些交換發(fa)生在具有相(xiang)同(tong)(tong)反向高度同(tong)(tong)源重復序(xu)列之間，導致它們之間遺傳物質(zhi)的(de)丟失（以及(ji)姐妹染色單體中的(de)相(xiang)互重復）。考慮到MSY的高度重復性體系結構，已經確定了許多不同的MSY重排。只有明確確定(ding)與(yu)男(nan)性不(bu)育相關的(de)才是本指南的(de)重點。

 

三、Y染色體缺失類型及其分子機制

圖2 Y染色體示意圖和臨床相關微缺失模式

 

本指南依舊沿用經典Y染色體微缺失區域的定義模式，分為：AZFa區缺失、AZFb區缺失、AZFbc區缺失和AZFc區缺失。

 AZFa區域：長792kb，包含單拷貝基因USP9Y（原DFFRY）和DDX3Y（原DBY）。第三個基因，UTY，功能未知，定位于該區遠端。AZFa完全缺失的起源可追溯到HERVyq1和HERVyq2逆轉錄病毒序列中同向的相同序列塊之間的NAHR。重組可發生在這些逆轉錄病毒序列（ID1和ID2）中兩個相同序列塊中的一個，導致至少兩種略有不同的缺失模式。無論如何，AZFa完全缺失都丟失了約792kb，包含USP9Y和DDX3Y缺失(shi)。

 AZFb和AZFc這兩個區域共包含24個不同的基因，其中大多數存在于多個拷貝中。AZFb完全缺失刪除了6.2Mb（包括32個轉錄單位），并且是由P5/近端P1回文之間的NAHR引起。因此，AZFb完全缺失也可以(yi)稱(cheng)為P5/近端(duan)P1缺失。AZFc區包括12個基因，每個基因以可變拷貝數存在，總共32個轉錄單元。AZFc完全缺失去除3.5Mb（共21個轉錄單元，其中10個被認為是蛋白質編碼），并分別源自回文P3和P1中b2和b4擴增子之間的NAHR。類似于AZFb缺失，AZFc完全缺(que)(que)失(shi)也可以基于(yu)NAHR事件的(de)干預靶點（即b2/b4缺(que)(que)失(shi)）來參(can)考。

 AZFb和AZFc區域的異常重復增加了額外重排的發生，這些重排也可能與它們對精子發生的影響有關。一些對應于幾乎全部去除AZFb和AZFc區域的缺失模式。這些AZFbc缺失是通過兩種主要機制發生的，涉及P5/遠端P1之間（7.7Mb，丟失42個轉錄單位）或P4/遠端P1之間（7.0Mb，失去38個轉錄單位）的NAHR。此外，AZFc區域內(nei)較少的(de)缺(que)失(shi)（部分缺(que)失(shi)）也(ye)會限制精子發生，這些是本指(zhi)南(nan)重點。

綜上所述，以(yi)下復(fu)發(fa)性Y染色體完全微缺(que)失具有臨床相關性，是無精(jing)子癥或嚴重少精(jing)癥男性生精(jing)障礙的原(yuan)因（圖2）：
—AZFa
—AZFb（P5/近端P1）
—AZFc（b2/b4）
—AZFbc（P5/遠端(duan)P1或P4/遠端(duan)P1）

最(zui)常見的完全缺(que)(que)失類型是AZFc缺(que)(que)失（70%-80%），其次(ci)是AZFa缺(que)(que)失（0.5%-9%）、AZFb缺(que)(que)失（1%-7%）和AZFbc缺(que)(que)失（1%-20%）。AZFabc缺(que)失最有可能與異常核(he)型有關，如46,XX男性或iso(Y)。

 

 

四、AZF完全缺失的基因型-表型相關性

AZF缺(que)失與生精(jing)失敗特異性相關(guan)。盡管已經報道了一些罕見的AZFc完全缺失自然傳播病例，但它們主要反映了這樣一個事實，即在特(te)殊條件(jian)下，精子(zi)數(shu)量非(fei)常低的男(nan)性可以進行(xing)自(zi)然(ran)受精。因此，將Y缺失(shi)視為無精(jing)子(zi)/少精(jing)子(zi)癥的原(yuan)因而不是“不育”的原(yuan)因更為合適。AZF缺失檢測具有預后價值，并可能(neng)影響治療選(xuan)擇(ze)。應(ying)為(wei)所有符合(he)TESE結合(he)卵胞(bao)漿內單精子注射（TESE-ICSI）條件的無精子癥患(huan)者(zhe)提供(gong)缺失篩查。

 AZFa區域完全缺失導致唯支持細胞綜合征（SCO）睪丸表型和無精子癥。AZFa區域完全缺失表明TESE-ICSI幾乎不(bu)可(ke)能取到睪丸精(jing)子。

 AZFb和AZFbc區域（P5/近(jin)端(duan)P1、P5/遠端(duan)P1、P4/遠端(duan)P1）完全缺失(shi)與無精(jing)子癥有關，大約一半的男性具有SCO睪丸表型，另一半表現為生精性阻滯（通常具有正常的FSH和正常的睪丸體積），從而阻止男性配子的成功產生。與(yu)AZFa完(wan)全缺失類似，AZFb完(wan)全缺失的男性也幾乎不可(ke)能通過TESE獲得(de)精子(zi)。然而，罕見的非典型AZFb或AZFbc缺失也可嘗試利用TESE進行取精，這種缺失(shi)特征為(wei)P4回文的近端斷點（而不是P5）。事實上，在P4處(chu)具(ju)有(you)近端斷點的(de)較小缺失可(ke)能與額外的(de)AZFb基因拷貝的(de)保留(liu)有(you)關，如XKRY、CDY2和HSFY，因(yin)此導致了TESE陽性(xing)結果的可能。同樣，通過保留遠(yuan)端sY1192位點（擴(kuo)展性(xing)缺(que)失(shi)分析的(de)一部分）確定的(de)部分AZFb缺(que)失(shi)也可以與殘余精子(zi)兼容。強調區分完全（P5/近端P1）和部分AZFb缺失的重要性(xing)。考慮到以上情況，新(xin)版指南建議在強制擴(kuo)展性缺(que)失(shi)分析步驟中，確定(ding)AZFb缺(que)失(shi)的遠端斷(duan)點時(shi)，將(jiang)sY1192作為首選(xuan)位點，而不是(shi)sY143。需要強調的是，不僅遠端斷點，近端斷點也可以區分TESE陰性和TESE陽性患者。因此，執行(xing)擴展性(xing)缺失分析是最重(zhong)要(yao)的，因(yin)為該信息將最終(zhong)確定是否(fou)應該嘗試TESE。只有完整的(de)檢測結果（包(bao)括基礎和擴展性缺(que)失(shi)位點）才能(neng)對AZFb缺(que)失(shi)男性的(de)生殖(zhi)選擇提供必要見解。在sY1192陰性P5/近端P1缺(que)失(shi)的(de)情況下，不建議使用TESE，因為提取到精子的機會非常低/幾乎為零。然而，應該注意的是，可能由于遺傳背景效應，sY1192陰性的AZFb和AZFbc缺失與完全精子發生(sheng)相兼容的情況雖極為罕見，但也有發生(sheng)。

 AZFc完全缺失（b2/b4）與無精子癥或嚴重少精子癥有關，對精子發生有強烈的有害影響。但與AZFa和AZFb相反，AZFc完全(quan)缺失也有可能有殘留精子(zi)發生。多項研究表明，與(yu)這種缺失類型(xing)相關的生精損傷表型(xing)會隨著時(shi)間的推移(yi)而(er)加重，但也有研究未能復現這種影響。AZFc完全缺(que)失患者通(tong)過(guo)TESE獲(huo)得精子的幾率平均約(yue)為50%，但差異很大（從15%到71%），一方面是患者自身生物學上的差異，另一方面也說明了TESE技術方面的差異。根據現有數據，外(wai)周血中45%以上(shang)的X細胞系可被認(ren)為是精子(zi)發生的負面(mian)預測因素。

 

五、遺傳咨詢

5.1 遺傳咨詢

遺傳咨詢是強制性環節，以向患者提供有關妊娠精子發生受損男性后代風險的相關信息。

 AZFc缺失以及AZFa和AZFb部分缺失，因為其可遺傳性，需要對其男性家庭(ting)成員進行(xing)遺傳(chuan)咨詢。

 AZFa、AZFb和AZFabc的完全缺失通常沒有精子產生，因此不(bu)建議進行家族篩(shai)查，也不(bu)應在報告中提及。

 非終端AZFbc缺失通常與非參考Y染色體相關，在一些非典型缺失病例中，盡管生精功能嚴重受損，但仍可能有精子發生。這類缺失(shi)將強制(zhi)性地傳遞(di)給其(qi)男性后代(dai)，因此(ci)，患者應被告(gao)知妊娠精子發生受損男性后代(dai)的風(feng)險。

 

5.2 生殖策略

 如果精(jing)液或睪丸中存在(zai)精(jing)子(zi)，AZF缺(que)(que)失(shi)患者可以自(zi)然受孕（在(zai)一些極罕(han)見(jian)的AZFc完(wan)全缺(que)(que)失(shi)的病(bing)例中）或通過MAR受孕。AZFc完全缺失患者行ICSI的研究已有報道，個別研究發現缺失對關鍵MAR參數有負面影響，如受精率、胚胎質量和活產率下降，但大(da)多(duo)數(shu)研究沒有(you)發現AZFc完全(quan)缺失(shi)與未缺失(shi)男性(xing)在受精率(lv)和妊娠率(lv)方(fang)面存在任(ren)何顯(xian)著(zhu)差(cha)異。因(yin)此，這種缺失(shi)是(shi)(shi)否(fou)對MAR結果(guo)有(you)任(ren)何顯著(zhu)影響仍然是(shi)(shi)一個有(you)爭議(yi)的(de)問題。近期一項(xiang)基(ji)于12項(xiang)研究的(de)薈萃分(fen)析表明，與沒有(you)遺傳異常的(de)患(huan)者（使用(yong)精液精子(zi)或睪丸精子(zi)）相(xiang)比(bi)，缺失(shi)患(huan)者除受精率(lv)(lv)顯著(zhu)下降外，其他生殖結果(guo)（如胚(pei)胎質量(liang)、臨床妊(ren)娠率(lv)(lv)、流(liu)產率(lv)(lv)和活產率(lv)(lv)）都(dou)沒有(you)變化。

 Y染色(se)體微缺失的傳(chuan)播對后代健康的潛(qian)在影響是一個激(ji)烈爭論的問題。雖然(ran)父(fu)親(qin)(qin)的(de)缺(que)(que)(que)失(shi)必然(ran)會遺(yi)傳(chuan)(chuan)給男性后代，從而導致(zhi)子(zi)代精子(zi)發生(sheng)(sheng)受損，但由于(yu)不同的(de)遺(yi)傳(chuan)(chuan)背景和(he)不同環境因素(su)對(dui)生(sheng)(sheng)殖功能的(de)影響，確切的(de)睪(gao)丸表型無法預測。據報(bao)道(dao)，受Yq微缺(que)(que)(que)失(shi)影響的(de)父(fu)親(qin)(qin)經(jing)ICSI所生(sheng)(sheng)嬰兒(er)的(de)數(shu)量仍然(ran)相對(dui)較低(di)，只有268例有充分(fen)記錄(lu)。這些(xie)兒(er)童(tong)中(zhong)，除了一名(ming)(ming)在出生(sheng)(sheng)時患有肺(fei)動脈閉鎖和(he)右心室發育(yu)不全以及一名(ming)(ming)患有非特定“嚴重(zhong)畸形(xing)”外，表型似(si)乎都(dou)正常；而這兩名(ming)(ming)兒(er)童(tong)的(de)父(fu)親(qin)(qin)都(dou)攜帶(dai)AZFc缺(que)(que)(que)失(shi)。人們對(dui)后代患特納(na)綜合(he)征（45,X）的(de)潛在風險以及與(yu)性染(ran)色體(ti)嵌(qian)合(he)體(ti)相關(guan)的(de)其他表型異常（包括生(sheng)(sheng)殖器(qi)模糊(hu)）表示擔憂。關(guan)于(yu)患有Y微缺(que)(que)(que)失(shi)的(de)男性和(he)具有嵌(qian)合(he)46,XY/45,X染(ran)色體(ti)核型和(he)/或Turner患者(zhe)數(shu)據表明，一些(xie)Yq微缺(que)(que)(que)失(shi)可能與(yu)整體(ti)Y染(ran)色體(ti)不穩定有關(guan)，這可能導致(zhi)45,X細胞系的(de)形(xing)成。在268例報(bao)告的(de)Yq缺(que)(que)(que)失(shi)父(fu)親(qin)(qin)所生(sheng)(sheng)的(de)ICSI嬰兒(er)中(zhong)，沒(mei)有觀(guan)察到生(sheng)(sheng)殖器(qi)模糊(hu)或特納(na)綜合(he)征。

 兩篇論文報(bao)道了對來(lai)自Y染色體缺(que)失(shi)攜(xie)帶者(zhe)的胚胎進(jin)行植入前遺傳(chuan)診斷，并提供了胚胎非整倍體率的數據。其中一項研究沒有發現性染色體異常，而另一項研究發現(xian)了更(geng)高比例的X單體胚胎(tai)。建(jian)議在與患者討論(lun)染(ran)色體異常的風險時要謹慎。此外，由于攜帶45,X染色體核型的胚胎有很高的自然流產風險，Yq缺失(shi)男性(xing)伴侶流產率可能更高。然而(er)，這(zhe)種可能性(xing)還(huan)有待正式檢驗。

 沒有證(zheng)據表明(ming)AZFc完全缺失與后代的智力(li)、心理或運動發(fa)育障礙有關(guan)。位于假常染色體區（PAR）的SHOX（矮(ai)小同源盒）基因的(de)(de)(de)單倍(bei)體充(chong)足性(xing)的(de)(de)(de)假定(ding)(ding)關聯在更大的(de)(de)(de)多中心研究中沒有(you)被復現(xian)(xian)，也(ye)沒有(you)在智(zhi)利人群(qun)的(de)(de)(de)獨立研究中發(fa)現(xian)(xian)。后(hou)者(zhe)(zhe)僅在等(deng)臂染色體Yp和(he)/或Y缺(que)對相(xiang)關的(de)(de)(de)終端(duan)AZFbc缺(que)失患者(zhe)(zhe)中發(fa)現(xian)(xian)了(le)PAR異常。這項研究還(huan)報道了(le)7名AZFbc終端(duan)缺(que)失和(he)核型(xing)異常患者(zhe)(zhe)中的(de)(de)(de)5名出現(xian)(xian)神經障礙。值得注意(yi)的(de)(de)(de)是，這一(yi)發(fa)現(xian)(xian)在更大的(de)(de)(de)隊列中的(de)(de)(de)驗證仍有(you)待確定(ding)(ding)。

總之，Y染色體微缺失(shi)的(de)分子診斷指征是基于嚴(yan)(yan)重生(sheng)精(jing)(jing)量減(jian)少，強(qiang)烈建議無(wu)精(jing)(jing)子癥(zheng)和(he)嚴(yan)(yan)重少精(jing)(jing)癥(zheng)患者進行檢測(ce)。然而(er)，需要AZF缺失檢(jian)測的嚴重少精癥(zheng)的閾值（1×106/mL至(zhi)5×106/mL精子濃度范(fan)圍內(nei)）仍存(cun)在爭議（見上(shang)文）。AZF檢測對精子提取具有預后價值，如果在精液或睪丸活檢中發現精子，則缺失將傳遞給男性后代。雖然數據存在異質性，但最新薈萃分析表明，除受精率外，Y染色體重排不會顯著影響MAR結果。盡管在過去10年間，父親Y染色體缺失所生嬰兒的數量進一步增加，但仍然沒有關于特納綜合征、生殖器模糊或其他染色體異常的確切風險的明確信息。顯然，有必要針對Yq缺失的男性及其潛在后代制定強有力的后續計劃。AZFc完(wan)全缺失(shi)和AZFb或AZFa部分缺失(shi)時，應在(zai)實驗(yan)室報告(gao)中要求對該(gai)家(jia)族(zu)的男性成員進行分析(xi)。此外，AZFc完(wan)全缺失或Yq終端缺失時，建議進行廣泛(fan)的核型分析（計數(shu)100個中期），以排除與結構(gou)異常的Y染色體相關的46,XY/45,X嵌合體。

 

六、AZF部分缺失

6.1 AZFa區域基因特異性缺失
盡管一些研究發現單個AZF基因缺失的發生頻率非常高，但這些數據與一項包含2000多名患者的大樣本研究結果大相徑庭。所有已確認的(de)AZF基因(yin)特異(yi)性缺(que)失(shi)（具有明確的(de)斷點(dian)）均位于AZFa區，其(qi)中(zhong)5個(ge)特異(yi)性缺(que)失(shi)部分或完全影響USP9Y基因。基因特異性缺失均不是由NAHR引起的，其特異性導致此類事件極為罕見，而且AZFa部分缺失的相關表型異質性很大，從無精子癥到正常精子癥都可能發生，提示(shi)USP9Y是精子發生過(guo)程中的精細調節(jie)因子，而并不(bu)是決定(ding)性因子。此外，DDX3Y的功能缺(que)失變(bian)異是無(wu)精子癥的病因，該基因也是AZFa區(qu)域的關鍵生(sheng)精因子。

6.2 AZFc部分缺失——gr/gr缺失及其臨床意義
AZFc區域特別容易受到NAHR事件的影響，從而可能導致部分缺失和重復。其中，gr/gr缺失是被研(yan)究得較為廣泛(fan)的一種，該缺失可以造(zao)成(cheng)AZFc區(qu)域近一半的基(ji)因(yin)丟失（具有生殖細胞獨有或顯性表達的基因）。gr/gr缺失(shi)的表型高度可變(bian)，從無(wu)精癥到(dao)正(zheng)常(chang)精子量(liang)表現不一，對生精的影(ying)響依然存在爭(zheng)議。且(qie)該缺失(shi)表型具有群體依賴性以及可能是TGCT的誘發因素，并可能在子代中擴展為AZFc區(qu)的完全(quan)缺失(shi)。因此，gr/gr缺(que)失(shi)是精(jing)子生成(cheng)障礙遺傳分(fen)析風險因素的一個特例，其是否作為常(chang)規(gui)檢測尚未達(da)成(cheng)共識，需由診(zhen)斷實驗(yan)室(shi)和送(song)檢臨床醫生自行(xing)決定。

6.3 診斷指南
檢測AZF缺失(shi)的首選方法是對Y染色體(ti)的選定區域進(jin)行(xing)PCR擴增。已有(you)研究(jiu)表明，與定位(wei)(wei)于非編碼(ma)區的(de)有(you)效位(wei)(wei)點相比，使用基(ji)因(yin)特異性序列位(wei)(wei)點（STS）并沒有(you)提(ti)高臨床(chuang)相關(guan)微缺(que)失的(de)檢測率。因(yin)此，從臨床(chuang)角度來看，所選(xuan)位(wei)(wei)點是擴(kuo)增匿名(ming)區域還是擴(kuo)增特定的(de)MSY基(ji)因(yin)基(ji)本上并不重要。真正至關(guan)重要的(de)是，所選(xuan)擇位(wei)(wei)點能夠(gou)顯示出(chu)一致的(de)微缺(que)失模式(shi)。

6.3.1 AZFa缺失檢測
AZFa區(qu)域的分子(zi)檢測使用兩個STS標記：sY84和sY86。兩者都位于USP9Y和DDX3Y基因上游。根據缺失的致病機制和現有數據，sY84和sY86同時缺失時，并不是100%的AZFa完全缺失，但其概率是非常高的，有可能（盡管很少）兩個位點都缺失而不影響AZFa的兩個基因，或只有USP9Y基因受到影響。因此，AZFa缺(que)失(shi)檢測需要進行強制性(xing)的擴展性(xing)缺(que)失(shi)分析，包括近(jin)端邊界sY82（present）/sY1064（absent）以及(ji)遠端邊界sY1065或(huo)sY1182（absent）/sY88（present）。近期數據表明，相當(dang)一部分AZFa完全(quan)缺失病例中，近端斷點標記sY83（既往版本作(zuo)為(wei)sY1064的等效選(xuan)項）仍然(ran)存在。因此，為了避免將AZFa完全缺失誤診為部分缺失，強烈建議在(zai)擴展性缺失分析中(zhong)使用sY1064而不(bu)是sY83（或(huo)者至少應該檢測sY1064，以證(zheng)實在(zai)sY83陽性病例中(zhong)確實是完(wan)全缺失）。這兩個AZFa基因位于AZFa區域更遠端，因此檢(jian)測推薦遠端AZFa位(wei)點與TESE預后非常(chang)相關，且近端斷點的(de)確切位(wei)置(zhi)（sY83存(cun)在(zai)或不存(cun)在(zai)）實(shi)際上并不影響對缺失的(de)臨床解釋。如果只發現sY84或(huo)sY86缺失(shi)(shi)（排(pai)除(chu)擴增失(shi)(shi)敗），則應對AZFa區域(yu)進(jin)行(xing)更詳細的研究。然而，這一事件目前被(bei)認為是(shi)非常罕見的。

6.3.2 AZFb缺失檢測
sY127和sY134分別位于AZFb區域的中端和遠端。根據現有數據，絕大(da)多數情況下，兩(liang)個位(wei)點缺失即可表明AZFb區域(yu)完全缺失。但為了明確TESE的預后，需要使用額外位點進行(xing)強制擴展性(xing)缺失分析，所(suo)選用位點包括：近端邊界的sY105（present）、sY121/sY1224（absent），以及遠(yuan)端邊界的sY1192（absent）和sY153（present）。需要注意的是，以前版本認為sY143或sY1192是可以等效的，但最近數據表明，sY1192（而(er)不是sY143）對TESE預后有價值(zhi)。此外，近期數據還表明，以前版本中推薦的sY1224（相當于(yu)sY121）在相當數量的AZFb和AZFbc完全缺失患者中仍然存在。盡(jin)管這(zhe)種(zhong)變異的表型仍有待表征，但(dan)強烈鼓勵使用位點sY121和sY1224（當sY121不存在(zai)時）。再次重申之前的建議，即反對檢測位點sY114和sY152（仍包含(han)在一些(xie)商業試劑(ji)盒中），因為(wei)它們(men)定(ding)位于染色體上多個基(ji)因組區域中。特別地，sY152定位于DAZ基因，類似于sY255和sY254。在這方面，再次強調，根(gen)據sY152的(de)假設缺(que)失定義的(de)所謂“AZFd”區域并不存(cun)在。盡管一(yi)些商業試劑盒仍然包含這個(ge)假定區域，但強烈建議不(bu)要使用(yong)此(ci)類產品。

6.3.3 AZFc缺失檢測
位點sY254和sY255是DAZ基(ji)因的特異性標記位點(dian)，DAZ基因在Y染色體序列中以四個拷貝的形式存在，排列在兩個簇中。當sY254和sY255同(tong)時缺失(shi)時，即可診斷AZFc區(qu)完全缺失(shi)。基于現有數據表明，這兩個位(wei)(wei)點(dian)(dian)中單(dan)一(yi)位(wei)(wei)點(dian)(dian)的缺失是極不(bu)可能的，提示方法學錯誤。強制擴展性缺(que)(que)失(shi)(shi)分(fen)析使用異染色質(zhi)位點(dian)sY160區分(fen)完全AZFc缺(que)(que)失(shi)(shi)（b2/b4缺(que)(que)失(shi)(shi)模式，sY160存(cun)在）和(he)終端缺(que)(que)失(shi)(shi)（sY1160缺(que)(que)失(shi)(shi)）。終端(duan)缺(que)失以及(ji)b2/b4缺(que)失可能與(yu)嵌合核型（46,XY/45,X）有關，因此，出于TESE預后原(yuan)因，也應(ying)要(yao)求(qiu)進行核型分(fen)析。

如果實驗室決(jue)定檢測(ce)gr/gr部分AZFc缺失(shi)，可以通過使用兩個(ge)位點來實現：sY1291和sY1191；位點sY1291缺失(shi)和sY1191存在即可進行判(pan)斷。值得注意的是，一項多中心研究中檢測到5%的假缺失率，強調了優化PCR條件和額外驗證步驟的重要性。建議對亞洲患者進行Y單(dan)倍(bei)群分析，以(yi)排除不太可能影響(xiang)精子(zi)發(fa)生(sheng)的Y譜系固定缺(que)失。

6.3.4 檢測AZFbc缺失
sY127、sY134、sY254和(he)(he)sY255四個位點全(quan)部缺失(shi)提示AZFb和(he)(he)AZFc區域均(jun)完全(quan)缺失(shi)。更特異性的位點sY116可以用于確(que)定AZFbc的缺(que)失(shi)模式，如P4/P1遠端缺失，sY116存在，或P5/P1遠端缺失時sY116也缺失，該定義具有臨床預后價值。強(qiang)烈建議AZFbc缺失(shi)時進行異染色(se)質位點sY160檢測，以確(que)定是否存(cun)在終(zhong)端缺失(shi)。

6.4 PCR反應體系的建立：內部質量控制和推薦位點
臨床診斷中，基(ji)(ji)因(yin)組DNA的PCR擴(kuo)增需要嚴格遵守良(liang)好的實驗(yan)室(shi)規范和質量控(kong)制的基(ji)(ji)本原則，檢測時(shi)必須平行(xing)檢測陽性(xing)和陰性(xing)對(dui)照。AZF缺(que)失(shi)檢測時，應(ying)(ying)同步檢測陽(yang)性和陰(yin)性對(dui)照，即一(yi)個精子發生正常的男性樣本和一(yi)個女性樣本。此外(wai)，需(xu)加入空(kong)白對(dui)照——水樣（只(zhi)是用(yong)水代替模板DNA，包含除模版DNA外(wai)所有成分的PCR反(fan)應(ying)(ying)）。每一(yi)組(zu)PCR反(fan)應(ying)(ying)都至少采用(yong)兩管或更好(hao)的多重PCR進行(xing)。SRY基因是男(nan)性(xing)性(xing)別(bie)決定基因，位(wei)于Y染色體短(duan)臂，作(zuo)為內對(dui)照，SRY基因可以在ZFY基因丟失時證明Y染色體特征序列的存在（比如：在XX男性中）。AZF診斷中另一個重要內對照是ZFX/ZFY基因，ZFX/ZFY檢測不僅與女性對照DNA相關，而且與SRY陰性的46,XX男性相關，是唯一的陽性標記。
原則上，在每個AZF區域中僅分析一個非多態性STS位點，就足以確定AZFa、AZFb或AZFc中是否存在缺失。然而，任何一個已知缺失區域都包括多個STS位點，分析每(mei)個區域中的(de)2個STS位點可(ke)以提高診斷的(de)準(zhun)確性(xing)。因此，在檢測的第一步（基礎檢測分(fen)析(xi)(xi)）中，每個AZF區域(yu)中至少應(ying)分(fen)析(xi)(xi)2個STS位點(dian)。基于眾多實驗室經驗，外部質量控制結果，并考慮到多重PCR擴增的形式，以前版本指南中推薦(jian)的(de)(de)STS引物的(de)(de)首選仍然有效(xiao)。這些引(yin)物包括：
AZFa：sY84*；sY86
AZFb：sY127；sY134
AZFc：sY254，sY255（均在DAZ基因中）

*更新了(le)sY84-F和sY84-R的序列。根據最新測序數據，sY84-F引物序(xu)(xu)列中間位置(zhi)存(cun)在錯配(pei)，新指南(nan)對(dui)引物序(xu)(xu)列進行了修正。關于sY84-R，在(zai)亞洲人(ren)群中檢測到(dao)引(yin)物序列(lie)第5核(he)苷酸位置存(cun)在(zai)一個基因多態性(xing)SNP（rs72609647）。因此，如果該來(lai)源(yuan)的(de)樣本擴增失敗，應檢測sY84的(de)替代(dai)引(yin)物和/或sY84的(de)替代(dai)鄰近位點。

對于強制(zhi)擴展性缺失(shi)分析，推薦的(de)引物為：
AZFa：近端斷點：sY82和sY1064；遠端斷點：sY1065（或sY1182）和sY88
AZFb：近端斷點：sY105和sY121/sY1224；遠端斷點：sY1192和sY153
AZ1Fc：sY160

總之，這兩種引(yin)物組(zu)的(de)使用足以(yi)(yi)用于常規(gui)診斷(duan)，能夠(gou)檢測幾乎所有臨床(chuang)相關的(de)AZF缺失(shi)以(yi)(yi)及(ji)文獻中報道的(de)95%以(yi)(yi)上的(de)缺失(shi)，同時為(wei)TESE提(ti)供足夠(gou)的(de)預后價值。強烈(lie)鼓勵(li)所有實(shi)驗(yan)室采用這(zhe)些位點，便于實(shi)驗(yan)室質量控制，并將檢測(ce)差(cha)異降至最(zui)低。

6.5 檢測結果及重復檢測結果解釋
指南建議的方案都經過認真設計和優化，采用兩管多重(zhong)PCR反(fan)應(ying)，每管多重(zhong)PCR反(fan)應(ying)體系(xi)中都(dou)包括每個區(qu)域的一(yi)個位點(dian)。因此，當(dang)樣(yang)本中(zhong)發生(sheng)完(wan)全缺失(shi)時，兩管(guan)PCR反應(ying)都應(ying)顯(xian)示該區(qu)域特異(yi)性(xing)位點(dian)缺失(shi)。雖然如果相關區域僅一個位點缺失，AZFa和AZFb區域的部分缺失是可能的，但僅sY254或sY255（AZFc/DAZ）的(de)選擇性單個位(wei)點缺失通常(chang)被視為方法學錯誤。如(ru)果(guo)只有一個(ge)AZFa或(huo)AZFb位(wei)點缺失(shi)，則首先(xian)必須仔細(xi)求證該(gai)缺失(shi)情況，然后對整個(ge)區域進(jin)行(xing)更(geng)詳細(xi)的研究(jiu)。如(ru)果(guo)AZFabc缺失(shi)（所有8個(ge)Yq位(wei)點都缺失(shi)），則對照位(wei)點（SRY和ZFX/ZFY）的解(jie)釋(shi)非常重要，以排(pai)除技術(shu)問題。
每個實驗室應根據可用的設備和試劑（如PCR儀和DNA聚合酶的類型）以及DNA質量/數量/來源，仔細優化PCR反應條件。如果(guo)結果(guo)不(bu)明確(que)和/或懷疑(yi)存(cun)在(zai)技術故障，則應(ying)重復進(jin)行多重反應(ying)。如果多重反應對特定的DNA樣本不起作用，則可以在單管反應中運行引物組。如果兩個多重PCR的結果一致支持缺失，則該缺失被確認。如果兩個多重PCR檢測的結果不一致，則應在單管PCR中重復整套引物。單管PCR不易發生擴增失敗，強烈建議在較(jiao)低的退火溫(wen)度下重復反應。為(wei)避(bi)免擴增失敗，應(ying)極力避(bi)免相(xiang)同引(yin)物的(de)重(zhong)復(fu)凍融。關(guan)于反應(ying)重(zhong)復(fu)次(ci)數，沒有一般(ban)性建議(yi)，應(ying)直到(dao)結果清(qing)晰和可重(zhong)復(fu)（良好的(de)實驗(yan)室(shi)建議(yi)）。

 

七、遺傳學檢測結果報告

報告應以標準化格式編寫，并應對非專業人員清晰友好。一般來說，報告必須清楚、簡明、準確和易于解釋，不可以接受手寫的報告。報(bao)告必須包括以下一般信(xin)息：

 送檢患者的醫生身份
 檢測和出具報告實驗室的清晰和完整的身份識別（包括唯一的實驗室編號/識別號碼）
 標題
 送檢和報告日期
 患者信息：完整姓名、姓氏、出生日期和生理性別
 樣本類型（如血液、口腔涂片等）
 非專業人員可以理解的書面解釋和結論
 （至少）兩名獨立評估人員的簽名（包括他們的職責）
 頁碼
 如果報告超過(guo)一頁(ye)(ye)，頁(ye)(ye)碼應(ying)該清晰（如第X頁(ye)(ye)/共Y頁(ye)(ye)），每(mei)頁(ye)(ye)都應(ying)有患者身份(fen)標識(shi)

還必須包括以下具體信息：
 以某種形式重述送檢的原因（如，對Y染色體微缺失的診斷）和適應癥（如，無精子癥、ICSI準備、pre-TESE等）。
 所用方法（如多重PCR擴增），包括檢測方法的局限性；如果使用了市售的試劑盒，則必須披露其名稱、制造商和批號。
 如果檢測/分析外包給外部實驗室或公司，必須清楚地說明這些信息。
 分析(xi)結(jie)果(guo)(guo)：必(bi)須報告被檢測(ce)位(wei)點的(de)結(jie)果(guo)(guo)。最好利用(yong)(yong)表格列出所有支持解(jie)釋(shi)的(de)STS位(wei)點結(jie)果(guo)(guo)（注意(yi)：如果(guo)(guo)使(shi)用(yong)(yong)了包含(han)大量(liang)位(wei)點的(de)試劑(ji)盒，建議(yi)在報告中只列出與解(jie)釋(shi)相關的(de)位(wei)點結(jie)果(guo)(guo)）。避免使(shi)用(yong)(yong)+和-，這可能會造成誤解(jie)，用(yong)(yong)單詞(ci)代(dai)替（例如，present/absent，或類似的(de)）。

7.1 Y微缺失檢測的替代方法
自1999年第一份指南發表以來，已經開發了多種評估Y染色體缺失的替代方法。此外，還提供了各種商業試劑盒。然而，這些往往包含不必要的大量位點，并由此混淆分析，最終導致“假性”缺失的診斷結果，尤其是在DNA質量和/或PCR條件不理想的情況下。此外，大多數試劑盒不能(neng)通過(guo)單管PCR對(dui)疑似缺失進行驗證。基于基因特異性位點的多重PCR方法允許檢測孤立的基因特異性缺失，但這些缺失的臨床意義極端罕見和不明確，阻礙了其在常規診斷中的應用。此外，這些試劑盒中包含基因特異性位點，需對結果進行特別仔細的解釋，并在可能的情況下驗證可疑的單基因缺失。
已公布的替(ti)代(dai)方(fang)法，部(bu)分基于指南(nan)，部(bu)分則沒(mei)有，主要包括毛細管電泳(yong)、real-time PCR、MLPA、aCGH或下一(yi)代(dai)測序(xu)（NGS）。real-time PCR的優點是相對快速，不涉及凝膠電泳，但所需的設備比標準方法更不容易獲得。AZF區域(yu)的特殊結構及其在不(bu)同(tong)人群中的顯著差異對廣泛實施基于(yu)NGS的方法提出了重(zhong)大挑戰(zhan)。這些挑戰(zhan)可能導致診斷(duan)錯(cuo)誤(wu)，并(bing)強烈建議在沒有適當(dang)驗證和(he)Y染色體分(fen)析(xi)的(de)廣泛專(zhuan)業知識(shi)的(de)診斷(duan)條件下考慮使用基于NGS的(de)方(fang)法(fa)時要謹慎。隨著這項技術的可用性和正確實施變得越來越普遍，它可能(neng)會帶來新的、更(geng)全面的檢測，從(cong)而進一(yi)步(bu)提高無精子癥男性的診(zhen)斷率。

總之，在以(yi)前(qian)版本的(de)指南中建立的(de)兩(liang)步多重PCR仍然是進行Y染色體缺(que)失(shi)檢測(ce)的(de)最(zui)(zui)具成(cheng)本效益、可(ke)重復性和(he)最(zui)(zui)容(rong)易獲得的(de)方法。如果實驗室決定建立替代方法，則需要在(zai)適當數量的(de)樣本上(shang)驗(yan)證新方法(fa)，包括陽(yang)性和陰性對照(zhao)，以評估檢測的(de)特異性和敏感(gan)性。無論何時采用替代方法，報告(gao)都應(ying)明確(que)包括(kuo)所使用的確(que)切實驗設計，而不(bu)是將其稱為“根據指南”。后者僅適用于(yu)本文所述的兩步多重PCR+強(qiang)制擴展性缺失分(fen)析。

 

八、EAA/EMQN外部質量評估22年經驗

強烈建(jian)議進(jin)行AZF檢(jian)測的實驗室(shi)加入年度“EQA計劃&rdquo;。該計劃每年向參與實驗室分發三份具有模擬臨床病例特征的、經驗證的DNA樣本，處理方式與患者樣本的處理方法完全相同，包括報告。實驗室結果由至(zhi)少(shao)兩名(ming)獨立評審員(yuan)進行評估。從2000年(nian)至2012年(nian)，參與該(gai)計(ji)劃的實驗室數量幾乎增加(jia)了兩倍，從57個增加(jia)到148個（圖3A），這(zhe)一(yi)數字在過去10年中一(yi)直(zhi)保持穩定。診斷錯誤率也急劇下降，從該項目開始前(qian)5年(nian)的近8%下(xia)降到(dao)目前(qian)的1%-2%（圖3B）。參(can)與(yu)評估的(de)診斷報告質(zhi)量和(he)結(jie)果(guo)解釋顯著(zhu)提(ti)高，在過去4年中，超過70%的(de)分析報告獲得滿分。值得注意的是，不必要的大量位點檢測&mdash;—通常是商用試(shi)劑盒(he)的一部分——仍然(ran)是解釋錯誤的主要來源。總之，這(zhe)一既(ji)定(ding)的(de)EAA/EMQN AZF方案已經證明，它是提高(gao)參與實驗室(shi)績效的(de)一個(ge)有(you)價值的(de)工具(ju)，建議進行AZF檢測(ce)的(de)實驗室(shi)都加入該(gai)年(nian)度計劃(hua)。

圖3 EAA/EMQN外部質量控制方案在評估實驗室績效方面的22年經驗結果

 

 

參考文獻：

[1] Krausz C, Navarro-Costa P, Wilke M, Tüttelmann F. EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions: State of the art 2023. Andrology. 2023;1-18. //doi.org/10.1111/andr.13514