摘要：Y染色體無精子癥因子（AZF）缺失檢測是診斷無精子癥和嚴重少精子癥的關鍵技術。作為2013年EAA/EMQN指南的修訂版，新版指南在回顧總結以往臨床相關進展的基礎上，對舊版指南內容進行了大量更新，并對EAA/EMQN提供的外部質量評估項目結果做出了反饋。基礎多重PCR檢測體系結合擴展性缺失(shi)分析(xi)，仍然是目前檢測和(he)正(zheng)確解釋(shi)AZF缺失(shi)的金標準。同時，對sY84引物序列進行了更新，且對AZFa和AZFb缺失斷點的可互換邊界位點也進行了改進。具(ju)體而言，新版指南(nan)不再推薦sY83和(he)sY143被用于擴展(zhan)性缺失分析，而是將sY1064和(he)sY1192作為首選(xuan)位點。盡管目前有些國家AZF缺失檢測正在向注冊試劑盒化過渡，但應注意的是，許多商業產品由于包含大量不必要位點而不被推薦使用。此外，目(mu)前這些可用產(chan)品都不符合用于擴(kuo)展性缺(que)失分析的新首選位點。AZFc區域gr/gr部分缺失是精子發生障礙人群特異性危險因素，也是睪丸生殖細胞腫瘤的易感因素。但這種(zhong)缺失類型的(de)檢測(ce)與否仍需由診斷實驗室和(he)送檢臨床醫生自(zi)行(xing)決定。鑒于EMQN/EAA計劃運行22年的經驗表明，參與計劃的實驗室基因型診斷錯誤率大幅下降，診斷報告質量也極大改善，強烈鼓(gu)勵AZF檢(jian)測實驗室(shi)每(mei)年參(can)與該外部質量控(kong)制計劃。

Y染色體無精子癥因子（azoospermia factor，AZF）缺失是導致男性不育的第二大遺傳因素，其發生率僅次于克氏綜合征。在普通人群中，約每4000名男性中就有1人存在Y染色體微缺失，而在不育男性中其發生率更高。不同(tong)實(shi)驗室AZF微缺失發生率(lv)為(wei)2%~10%（甚至更高(gao)），主要由研究人群組成差異導致。通常，接受外部機構送檢的常規診斷實驗室在沒有控制患者選擇的情況下的發病率要低得多，通常低于2%。
已發表數據和(he)質(zhi)量(liang)控(kong)制(zhi)計劃(hua)都證實(shi)(shi)，不同(tong)實(shi)(shi)驗(yan)室采取的(de)檢(jian)測(ce)方案差異，確(que)實(shi)(shi)會導致不準確(que)或完(wan)全(quan)錯誤的(de)診斷，表明檢(jian)測(ce)標(biao)準化(hua)和(he)質(zhi)量(liang)控(kong)制(zhi)的(de)必要性。也(ye)因此，歐洲男科學會（EAA）和(he)分子遺傳質(zhi)量(liang)協作網（EMQN CIC）聯(lian)合開始提供外部質(zhi)量(liang)評估（EQA）計劃(hua)，并定期(qi)發布(bu)Y染色(se)體微缺失分子診斷的(de)實(shi)(shi)驗(yan)室指(zhi)南。

經10年數據(ju)積累，本次EAA/EMQN關(guan)于Y染色體(ti)AZF微缺失分(fen)子診斷指南作出了大(da)量更新(xin)，以更好服務于臨床。更新(xin)要點：
01 AZFa近(jin)端邊界位點(dian)sY83和sY1064不可互換，因為它們的結果取決于檢測到的AZFa完全缺失近端斷點的變化。重要的是，AZFa完(wan)全(quan)缺失可以與sY83（present）和(he)sY1064（absent）兼容。因此，在強制擴展性缺失分析中只推薦(jian)sY1064，而不(bu)推薦(jian)sY83。
02 AZFb遠端邊界位點sY143和sY1192不(bu)能互換，只有sY1192能夠區分AZFb完全和部分缺失（從而(er)為(wei)TESE成功與否提供可靠預后）。因此，在強制擴展性缺失分析中(zhong)只(zhi)推薦sY1192，而不推薦sY143。
03 對sY84的正向引物和反向引物序列進行了更新，以避免正向引物錯配，同時反向引物兼容亞洲人群的SNP。
04 AZFb缺失斷點的可變性可導致大量AZFb和AZFbc完全缺失中sY1224近端邊界位點的保留。盡管這種變異的表型尚不清楚，但建議(yi)優先使(shi)用sY121，再使(shi)用sY1224（如果sY121缺失）。
05 據目前所知，擴展性缺失分析中首選位點的(de)變化與目(mu)前市面(mian)上任何(he)AZF缺失分子診斷試劑盒(he)都不(bu)完全兼容。

一、Y染色體微缺失遺傳學檢測的適應癥

AZF缺(que)失檢測的(de)精液評估閾值尚未達(da)成共(gong)識。精子濃度<2×106/mL的無精癥或嚴重少精癥患者一般能夠發現臨床相關的缺失，而精子濃度在2~5×106/mL之間的不育患者很少有此發現。2010版《WHO人類精液檢查和處理實驗室手冊》將生精指標改為精子總數，歐洲臨床指(zhi)南(nan)現今仍然將AZF缺失(shi)檢(jian)測(ce)的精子總數(shu)閾(yu)值(zhi)設定(ding)為(wei)＜500萬精子/mL；然而，在(zai)精子濃度>1×106/mL的男性中，該檢(jian)測(ce)的成本效益受到質疑。但無論如何，一(yi)致建議對無精子癥男性進(jin)行(xing)Y染色體缺失(shi)篩查，因為它不僅可以提供病因診(zhen)斷，而且可以對TESE的成功(gong)率(lv)進行可靠估計(ji)。

圖1為本指南建議的分析步驟流程圖，分為基礎檢測體系和擴展性檢測體系。常規臨床參數(shu)，如激素水平(ping)、睪(gao)丸體積(ji)、精索(suo)靜(jing)脈曲張(zhang)、睪(gao)丸發育(yu)不良、感染等，沒(mei)有任何預(yu)測價值。通常，染色體異常（46,XY/45,X核型除(chu)外）、梗阻(zu)性無精子癥（除(chu)非FSH高于正常限值）或促(cu)性腺功(gong)能減退癥患者不需(xu)要進行Y染色體分子分析。然而，在非特發(fa)性不(bu)育(yu)男性中已經發(fa)現了許(xu)多(duo)缺(que)失攜帶者，即患有睪丸腫瘤、附睪閉塞、睪丸炎、精索靜脈曲張或化療/放療后的患者。因此，任何伴(ban)有(you)無精(jing)子癥(zheng)或嚴重(zhong)少精(jing)癥(zheng)的診斷都應該(gai)是AZF檢測(ce)的指征。例如，對屬于上述精液類別的男性，在精索靜脈曲張切除術前進行AZF篩查很重要，因為缺失攜帶者很可能不會從手術中受益。Klinefelter患者檢測Y染(ran)色(se)體缺失的臨床實用性尚未確定。

圖1（A）AZF基礎檢測體系及診斷流程

圖1（B）AZF擴展性缺失檢測體系及診斷流程

二、Y染(ran)色體男性特異性區域結(jie)構

Y染色體男性特異性區域（MSY）參考序列包含156個轉錄單位（其中包括78個蛋白質編碼基因，編碼27種不同的蛋白質），分為三種類型：X-退化區（X-degenerate；來自染色體祖先狀態的單拷貝基因或假基因）、X-換位區（X-transposed；從X染色體獲得，與相應的X區域99%同源）以及擴增區（ampliconic）。其中，后者對應于重復區，分為多個家族類型，每個重復區在家族內重復之間共享幾乎完全（>99.9%）的同一性。擴增區包含9個睪丸特異性或富集表達的蛋白質編碼基因家族。最初，這些家族估計至少有60個編碼基因，現在這個(ge)數(shu)字已經增(zeng)加到超(chao)過100個(ge)。由于擴增區的高度重復性，既可以進行基因轉換，也可以進行非等位基因（染色體內）同源重組（NAHR）。擴增子可以沿著MSY以有序的方式排列，從而形成回文：在MSY的相當長范圍內延伸的不同擴增子重復的鏡像塊。擴增子（和回文）組織增強了結構變異的產生，如缺失、重復和倒位。普遍認為，NAHR是產生AZF完全缺失的主要驅動力。這(zhe)些交換發(fa)生在具有相同(tong)反向高度同(tong)源重復序列之間，導致它們之間遺(yi)傳物質的丟失（以及姐妹(mei)染色單體中(zhong)的相互重復）。考慮到MSY的高度重復性體系結構，已經確定了許多不同的MSY重排。只有明(ming)確確定與男性(xing)不育相關的才是本指南(nan)的重(zhong)點。

三、Y染色體缺失類型及其分子機制

圖2 Y染色體示意圖和臨床相關微缺失模式

本指南依舊沿用經典Y染色體微缺失區域的定義模式，分為：AZFa區缺失、AZFb區缺失、AZFbc區缺失和AZFc區缺失。

 AZFa區域：長792kb，包含單拷貝基因USP9Y（原DFFRY）和DDX3Y（原DBY）。第三個基因，UTY，功能未知，定位于該區遠端。AZFa完全缺失的起源可追溯到HERVyq1和HERVyq2逆轉錄病毒序列中同向的相同序列塊之間的NAHR。重組可發生在這些逆轉錄病毒序列（ID1和ID2）中兩個相同序列塊中的一個，導致至少兩種略有不同的缺失模式。無論如何，AZFa完全缺失都丟失了約792kb，包含USP9Y和DDX3Y缺失。

 AZFb和AZFc這兩個區域共包含24個不同的基因，其中大多數存在于多個拷貝中。AZFb完全缺失刪除了6.2Mb（包括32個轉錄單位），并且是由P5/近端P1回文之間的NAHR引起。因此，AZFb完全缺失也可以(yi)稱為P5/近端P1缺失。AZFc區包括12個基因，每個基因以可變拷貝數存在，總共32個轉錄單元。AZFc完全缺失去除3.5Mb（共21個轉錄單元，其中10個被認為是蛋白質編碼），并分別源自回文P3和P1中b2和b4擴增子之間的NAHR。類似于AZFb缺失，AZFc完(wan)全缺(que)失也可以基于NAHR事件的干預靶點（即b2/b4缺(que)失）來參考。

 AZFb和AZFc區域的異常重復增加了額外重排的發生，這些重排也可能與它們對精子發生的影響有關。一些對應于幾乎全部去除AZFb和AZFc區域的缺失模式。這些AZFbc缺失是通過兩種主要機制發生的，涉及P5/遠端P1之間（7.7Mb，丟失42個轉錄單位）或P4/遠端P1之間（7.0Mb，失去38個轉錄單位）的NAHR。此外，AZFc區域內較(jiao)少的缺失（部分缺失）也會限制精子發生，這(zhe)些是本(ben)指南重點。

綜上所述，以下復發性(xing)Y染色體完全微(wei)缺失具有(you)臨(lin)床相(xiang)關性(xing)，是無精(jing)子癥或嚴重少(shao)精(jing)癥男性(xing)生精(jing)障礙(ai)的原(yuan)因（圖2）：
—AZFa
—AZFb（P5/近端P1）
—AZFc（b2/b4）
—AZFbc（P5/遠端(duan)P1或P4/遠端(duan)P1）

最(zui)常見(jian)的完全(quan)缺(que)(que)失類(lei)型(xing)是(shi)AZFc缺(que)(que)失（70%-80%），其次是(shi)AZFa缺(que)(que)失（0.5%-9%）、AZFb缺(que)(que)失（1%-7%）和AZFbc缺(que)(que)失（1%-20%）。AZFabc缺失最(zui)有(you)可能與異常核型有(you)關，如46,XX男性或iso(Y)。

四、AZF完全缺失的基因型-表型相關性

AZF缺失與生精(jing)失敗特異性相關。盡管已經報道了一些罕見的AZFc完全缺失自然傳播病例，但它們主要反映了這樣一個事實，即在特(te)殊條(tiao)件下，精子數(shu)量非常低的(de)男性可以進行自(zi)然受精。因此，將Y缺(que)失視為(wei)無精子/少(shao)精子癥的(de)原因而不(bu)是“不(bu)育”的(de)原因更為(wei)合(he)適。AZF缺(que)失檢(jian)測具(ju)有預后價值(zhi)，并可(ke)能(neng)影響治(zhi)療(liao)選(xuan)擇(ze)。應(ying)為所有符合TESE結合卵胞(bao)漿內(nei)單精子(zi)注射(she)（TESE-ICSI）條件(jian)的無精子(zi)癥患者提(ti)供缺(que)失篩(shai)查。

 AZFa區域完全缺失導致唯支持細胞綜合征（SCO）睪丸表型和無精子癥。AZFa區域完全缺失表明(ming)TESE-ICSI幾乎(hu)不可能取到睪丸(wan)精子。

 AZFb和AZFbc區域（P5/近(jin)端(duan)P1、P5/遠端(duan)P1、P4/遠端(duan)P1）完全缺失與無精子癥有關，大約一半的男性具有SCO睪丸表型，另一半表現為生精性阻滯（通常具有正常的FSH和正常的睪丸體積），從而阻止男性配子的成功產生。與AZFa完全(quan)缺(que)(que)失(shi)類似，AZFb完全(quan)缺(que)(que)失(shi)的男性(xing)也幾乎不可能通過TESE獲得精子。然而，罕見的(de)非典型(xing)AZFb或AZFbc缺失也可(ke)嘗試利用TESE進行取精(jing)，這種缺失特征為P4回文的近端斷點（而不是(shi)P5）。事實上，在P4處(chu)具有近端斷點(dian)的較(jiao)小缺(que)失可能(neng)與(yu)額(e)外的AZFb基因拷(kao)貝的保留有關，如XKRY、CDY2和HSFY，因此導致了TESE陽性結果的可能。同樣，通過保留遠(yuan)端sY1192位點（擴展性缺失(shi)分析的(de)(de)一部分）確定(ding)的(de)(de)部分AZFb缺失(shi)也可以與殘余精(jing)子兼容。強調區分完全(quan)（P5/近端P1）和部分AZFb缺失(shi)的(de)重要性(xing)。考慮到以上情況，新版指南建議在強(qiang)制擴展性缺失分(fen)析步驟中(zhong)，確定AZFb缺失的遠(yuan)端斷點(dian)時，將sY1192作為首選位點(dian)，而(er)不是sY143。需要強調的是，不僅遠端斷點，近端斷點也可以區分TESE陰性和TESE陽性患者。因此，執行(xing)擴展(zhan)性(xing)缺(que)失分析是最(zui)重要的，因為該(gai)(gai)信息將(jiang)最(zui)終確定是否應該(gai)(gai)嘗試TESE。只有完整的(de)(de)檢測(ce)結果（包括基礎和(he)擴展(zhan)性缺(que)失位點(dian)）才能對AZFb缺(que)失男性的(de)(de)生殖選擇提供必要見解。在sY1192陰性P5/近端P1缺(que)失的(de)(de)情況下，不建議(yi)使用TESE，因為提取到精子的機會非常低/幾乎為零。然而，應該注意的是，可能由于遺傳背景效應，sY1192陰(yin)性的AZFb和AZFbc缺失與完全精子發生相兼容的情(qing)況雖(sui)極為(wei)罕見，但也有發生。

 AZFc完全缺失（b2/b4）與無精子癥或嚴重少精子癥有關，對精子發生有強烈的有害影響。但與AZFa和AZFb相反，AZFc完全缺失也有可(ke)能有殘(can)留(liu)精子發生。多項研究表明，與(yu)這種缺失類型(xing)相關的生精損傷表型(xing)會隨著時間的推移(yi)而加重，但也有研究未能復現這種影響。AZFc完全缺(que)失患者通過TESE獲得精(jing)子(zi)的幾率平均約為50%，但差異很大（從15%到71%），一方面是患者自身生物學上的差異，另一方面也說明了TESE技術方面的差異。根據現有數據，外周血中45%以上的(de)X細胞系可被認為(wei)是(shi)精子發生的(de)負面(mian)預(yu)測因素。

五、遺傳咨詢

5.1 遺傳咨詢

遺傳咨詢是強制性環節，以向患者提供有關妊娠精子發生受損男性后代風險的相關信息。

 AZFc缺失以及AZFa和AZFb部分缺失，因為其可遺傳性，需要對其男性家庭(ting)成(cheng)員(yuan)進行遺傳咨詢(xun)。

 AZFa、AZFb和AZFabc的完全缺失通常沒有精子產生，因此不建議(yi)進行家(jia)族篩查，也不應在(zai)報告中提及。

 非終端AZFbc缺失通常與非參考Y染色體相關，在一些非典型缺失病例中，盡管生精功能嚴重受損，但仍可能有精子發生。這類缺失將強制(zhi)性地傳遞給其男(nan)性后代(dai)，因此，患者應被(bei)告知(zhi)妊娠(shen)精子發生受(shou)損男(nan)性后代(dai)的風險。

5.2 生殖策略

 如果精液(ye)或(huo)睪丸中存在(zai)(zai)精子，AZF缺失患者可以自然(ran)受(shou)(shou)孕（在(zai)(zai)一些極(ji)罕見的(de)AZFc完全缺失的(de)病例中）或(huo)通(tong)過MAR受(shou)(shou)孕。AZFc完全缺失患者行ICSI的研究已有報道，個別研究發現缺失對關鍵MAR參數有負面影響，如受精率、胚胎質量和活產率下降，但大多(duo)數研究沒有發現AZFc完全缺(que)失與未(wei)缺(que)失男性在受精率和妊娠率方面存(cun)在任何顯(xian)著差異(yi)。因此，這種(zhong)缺失是否對MAR結(jie)(jie)果有任何顯著影響仍然是一個有爭議的問題。近期一項基于12項研究(jiu)的薈萃分(fen)析表明，與沒(mei)有遺傳異常的患者（使(shi)用精(jing)液精(jing)子(zi)或睪(gao)丸(wan)精(jing)子(zi)）相比(bi)，缺失患者除受精(jing)率(lv)(lv)顯著下降外，其他生(sheng)殖結(jie)(jie)果（如胚胎(tai)質量(liang)、臨床(chuang)妊娠率(lv)(lv)、流(liu)產(chan)率(lv)(lv)和活產(chan)率(lv)(lv)）都沒(mei)有變化。

 Y染色體(ti)微缺(que)失(shi)的傳播對后(hou)代健康的潛(qian)在影響是(shi)一(yi)個激烈爭(zheng)論的問題。雖然(ran)(ran)父親(qin)的(de)(de)缺(que)(que)失(shi)必(bi)然(ran)(ran)會遺傳給男(nan)性后(hou)代，從而(er)導致子代精子發生(sheng)(sheng)受損(sun)，但由于不同(tong)的(de)(de)遺傳背景(jing)和不同(tong)環境因素對生(sheng)(sheng)殖功能(neng)(neng)的(de)(de)影(ying)(ying)響，確切(qie)的(de)(de)睪(gao)丸表(biao)(biao)型(xing)無(wu)法預測。據報道，受Yq微缺(que)(que)失(shi)影(ying)(ying)響的(de)(de)父親(qin)經ICSI所生(sheng)(sheng)嬰兒(er)(er)(er)(er)的(de)(de)數量仍然(ran)(ran)相(xiang)對較低(di)，只有(you)268例(li)有(you)充分記錄(lu)。這些兒(er)(er)(er)(er)童(tong)中，除了一(yi)名在(zai)出生(sheng)(sheng)時患(huan)(huan)有(you)肺動(dong)脈閉(bi)鎖和右心室發育不全(quan)以及一(yi)名患(huan)(huan)有(you)非特定“嚴重畸形”外，表(biao)(biao)型(xing)似(si)乎都正常；而(er)這兩名兒(er)(er)(er)(er)童(tong)的(de)(de)父親(qin)都攜帶AZFc缺(que)(que)失(shi)。人(ren)們對后(hou)代患(huan)(huan)特納綜合(he)(he)征(zheng)（45,X）的(de)(de)潛在(zai)風險以及與(yu)(yu)性染色體(ti)嵌(qian)合(he)(he)體(ti)相(xiang)關的(de)(de)其他表(biao)(biao)型(xing)異(yi)常（包括生(sheng)(sheng)殖器模糊）表(biao)(biao)示擔憂。關于患(huan)(huan)有(you)Y微缺(que)(que)失(shi)的(de)(de)男(nan)性和具有(you)嵌(qian)合(he)(he)46,XY/45,X染色體(ti)核型(xing)和/或(huo)Turner患(huan)(huan)者數據表(biao)(biao)明，一(yi)些Yq微缺(que)(que)失(shi)可能(neng)(neng)與(yu)(yu)整(zheng)體(ti)Y染色體(ti)不穩定有(you)關，這可能(neng)(neng)導致45,X細胞系的(de)(de)形成。在(zai)268例(li)報告的(de)(de)Yq缺(que)(que)失(shi)父親(qin)所生(sheng)(sheng)的(de)(de)ICSI嬰兒(er)(er)(er)(er)中，沒有(you)觀察到生(sheng)(sheng)殖器模糊或(huo)特納綜合(he)(he)征(zheng)。

 兩(liang)篇論文報道了對來自Y染色體(ti)(ti)缺失攜帶者的(de)胚胎進(jin)行植入前遺(yi)傳診斷，并提供(gong)了胚胎非整(zheng)倍體(ti)(ti)率的(de)數(shu)據。其中一項研究沒有發現性染色體異常，而(er)另一項(xiang)研究發(fa)現了更高比例的X單體胚(pei)胎。建議(yi)在與患者(zhe)討論染(ran)色體(ti)異常的(de)風險時要謹慎。此外，由于攜帶45,X染色體核型的胚胎有很高的自然流產風險，Yq缺失男性伴(ban)侶流產率可能更高。然而，這種可能性還有待正式檢驗。

 沒有(you)證據表(biao)明(ming)AZFc完全缺失與后(hou)代的智力、心理或運動發育障礙有(you)關。位于假常染色體區（PAR）的SHOX（矮(ai)小同源(yuan)盒）基因的(de)單倍體(ti)充足(zu)性(xing)的(de)假定(ding)關聯(lian)在更大的(de)多中(zhong)(zhong)心(xin)研(yan)究(jiu)中(zhong)(zhong)沒(mei)有被復(fu)現，也沒(mei)有在智利人群的(de)獨立研(yan)究(jiu)中(zhong)(zhong)發(fa)(fa)現。后者僅在等臂染色體(ti)Yp和/或Y缺(que)對相關的(de)終端AZFbc缺(que)失患(huan)(huan)者中(zhong)(zhong)發(fa)(fa)現了PAR異常。這(zhe)項(xiang)研(yan)究(jiu)還報(bao)道了7名AZFbc終端缺(que)失和核型(xing)異常患(huan)(huan)者中(zhong)(zhong)的(de)5名出(chu)現神經障礙。值得(de)注意的(de)是，這(zhe)一發(fa)(fa)現在更大的(de)隊列中(zhong)(zhong)的(de)驗(yan)證仍有待確定(ding)。

總之，Y染色體微缺失的分子診斷指(zhi)征是基于嚴重生(sheng)精量(liang)減少(shao)，強烈建議無精子癥(zheng)和嚴重少(shao)精癥(zheng)患者(zhe)進行檢(jian)測。然而(er)，需要AZF缺(que)失(shi)檢測的嚴重少(shao)精癥的閾(yu)值（1×106/mL至5×106/mL精子濃度范(fan)圍內）仍存在(zai)爭議（見(jian)上(shang)文）。AZF檢測對精子提取具有預后價值，如果在精液或睪丸活檢中發現精子，則缺失將傳遞給男性后代。雖然數據存在異質性，但最新薈萃分析表明，除受精率外，Y染色體(ti)重排不會顯著影(ying)響MAR結(jie)果(guo)。盡管在過去10年間，父親Y染色體缺失所生嬰兒的數量進一步增加，但仍然沒有關于特納綜合征、生殖器模糊或其他染色體異常的確切風險的明確信息。顯然，有必要針對Yq缺失的男性及其潛在后代制定強有力的后續計劃。AZFc完全缺(que)失和AZFb或(huo)AZFa部分(fen)缺(que)失時，應在實(shi)驗室報告中要(yao)求對該(gai)家(jia)族的男(nan)性成員進行分(fen)析。此外，AZFc完全(quan)缺失或Yq終端缺失時(shi)，建議(yi)進(jin)行廣泛的核(he)型分析(xi)（計(ji)數100個(ge)中期(qi)），以排除與(yu)結(jie)構異常的Y染色(se)體(ti)相關的46,XY/45,X嵌合體(ti)。

六、AZF部分缺失

6.1 AZFa區域基因特異性缺失
盡管一些研究發現單個AZF基因缺失的發生頻率非常高，但這些數據與一項包含2000多名患者的大樣本研究結果大相徑庭。所(suo)有已確(que)認的AZF基因特異性(xing)缺(que)失（具有明(ming)確(que)的斷點）均位于AZFa區，其中(zhong)5個特異性(xing)缺(que)失部(bu)分(fen)或完(wan)全影(ying)響USP9Y基因。基因特異性缺失均不是由NAHR引起的，其特異性導致此類事件極為罕見，而且AZFa部分缺失的相關表型異質性很大，從無精子癥到正常精子癥都可能發生，提(ti)示USP9Y是精(jing)子(zi)(zi)(zi)發生(sheng)過程中的精(jing)細調(diao)節因子(zi)(zi)(zi)，而(er)并不(bu)是決定性因子(zi)(zi)(zi)。此外，DDX3Y的功(gong)能缺失變異(yi)是(shi)無精(jing)子癥的病因(yin)，該基因(yin)也是(shi)AZFa區域的關(guan)鍵生(sheng)精(jing)因(yin)子。

6.2 AZFc部分缺失——gr/gr缺失及其臨床意義
AZFc區域特別容易受到NAHR事件的影響，從而可能導致部分缺失和重復。其中，gr/gr缺(que)(que)失(shi)是(shi)被研究得較為廣泛的(de)一種，該缺(que)(que)失(shi)可以造成AZFc區域近一半的(de)基因丟(diu)失(shi)（具有生殖細胞獨有或顯性表達的基因）。gr/gr缺失的表型(xing)(xing)高度可(ke)(ke)變，從無精(jing)癥到正常(chang)精(jing)子(zi)量表現不一，對生精(jing)的影響依然存在爭議。且該缺失表型(xing)(xing)具(ju)有群體依賴性以及(ji)可(ke)(ke)能是TGCT的誘發(fa)因素，并可(ke)(ke)能在子(zi)代中擴(kuo)展為AZFc區的完全(quan)缺失。因此，gr/gr缺失是(shi)精子生(sheng)成障礙遺傳分析風險因素的一個特例，其是(shi)否作為常規(gui)檢測(ce)尚未達(da)成共識，需由診斷實驗室和送檢臨床醫(yi)生(sheng)自行決定。

6.3 診斷指南
檢測AZF缺失的首選方法(fa)是對Y染色(se)體的選定(ding)區域進行PCR擴增。已有(you)研究(jiu)表明，與定位于非編碼區的有(you)效(xiao)位點(dian)(dian)(dian)相(xiang)比(bi)，使用基因(yin)(yin)特(te)異(yi)性序列位點(dian)(dian)(dian)（STS）并沒(mei)有(you)提高臨(lin)床相(xiang)關微缺(que)失的檢測(ce)率。因(yin)(yin)此，從臨(lin)床角度來看，所(suo)選位點(dian)(dian)(dian)是(shi)擴(kuo)增匿名區域(yu)還是(shi)擴(kuo)增特(te)定的MSY基因(yin)(yin)基本上并不重(zhong)(zhong)要(yao)。真正(zheng)至關重(zhong)(zhong)要(yao)的是(shi)，所(suo)選擇(ze)位點(dian)(dian)(dian)能夠(gou)顯示出一致(zhi)的微缺(que)失模(mo)式。

6.3.1 AZFa缺失檢測
AZFa區(qu)域(yu)的分(fen)子檢(jian)測使用兩(liang)個STS標(biao)記：sY84和sY86。兩者都位于USP9Y和DDX3Y基因上游。根據缺失的致病機制和現有數據，sY84和sY86同時缺失時，并不是100%的AZFa完全缺失，但其概率是非常高的，有可能（盡管很少）兩個位點都缺失而不影響AZFa的兩個基因，或只有USP9Y基因受到影響。因此，AZFa缺(que)失檢(jian)測需要進行強制(zhi)性的擴展(zhan)性缺(que)失分(fen)析，包括近端(duan)邊界sY82（present）/sY1064（absent）以及遠端(duan)邊界sY1065或sY1182（absent）/sY88（present）。近期數據表明，相當一部(bu)分AZFa完全缺(que)失病例中，近端斷點標(biao)記sY83（既(ji)往版本作為sY1064的等效選項(xiang)）仍(reng)然存(cun)在。因此，為了避免將AZFa完全缺失誤診為部分缺失，強烈建議在擴展性缺失分析中使(shi)用(yong)sY1064而不是(shi)sY83（或者至(zhi)少應該檢測sY1064，以證實在sY83陽性病例中確實是(shi)完全缺失）。這兩個AZFa基因位于AZFa區域更遠端，因此檢測推(tui)薦遠端AZFa位點與TESE預(yu)后非常相關(guan)，且近(jin)端斷點的確切位置（sY83存(cun)在或不(bu)存(cun)在）實(shi)際上并不(bu)影(ying)響對缺失(shi)的臨床解釋。如果只發現sY84或(huo)sY86缺失（排除(chu)擴(kuo)增失敗），則應對AZFa區域進行更詳細(xi)的(de)(de)研究。然(ran)而，這一(yi)事件目前被認為是非(fei)常罕見的(de)(de)。

6.3.2 AZFb缺失檢測
sY127和sY134分(fen)別位于(yu)AZFb區(qu)域(yu)的中端和遠(yuan)端。根據現有數據，絕大多數情(qing)況下，兩個位點缺(que)失即可表(biao)明AZFb區域完(wan)全缺(que)失。但為了明確TESE的預后，需要(yao)使用(yong)額外(wai)位點進行強(qiang)制擴(kuo)展(zhan)性缺失分析，所選(xuan)用(yong)位點包括：近端邊界的sY105（present）、sY121/sY1224（absent），以及遠(yuan)端邊界的sY1192（absent）和sY153（present）。需要注意的是，以前版本認為sY143或sY1192是可以等效的，但最近數據表明，sY1192（而不是sY143）對TESE預后(hou)有價值(zhi)。此外，近期數據還表明，以前版(ban)本(ben)中(zhong)推(tui)薦(jian)的(de)sY1224（相(xiang)當于sY121）在相(xiang)當數量的(de)AZFb和AZFbc完全缺失患者中(zhong)仍然存在。盡管(guan)這種變異的表型仍有待表征，但(dan)強烈(lie)鼓勵使用位點sY121和sY1224（當sY121不(bu)存在時(shi)）。再次重申之前的建議，即反對檢測位(wei)(wei)點sY114和sY152（仍包含在一些商業試(shi)劑(ji)盒中），因(yin)為它們定位(wei)(wei)于染(ran)色體上(shang)多個基因(yin)組區域中。特別地，sY152定位于DAZ基因，類似于sY255和sY254。在這方面，再次強調，根據sY152的假設缺失定義的所謂“AZFd”區域(yu)并不存在。盡管(guan)一些商業試劑盒仍然包含這個假定區域，但強烈(lie)建議不(bu)要使(shi)用此類產(chan)品(pin)。

6.3.3 AZFc缺失檢測
位點sY254和sY255是DAZ基因的特(te)異性標記位點，DAZ基因在Y染色體序列中以四個拷貝的形式存在，排列在兩個簇中。當(dang)sY254和sY255同時(shi)缺失時(shi)，即可診斷AZFc區完(wan)全缺失。基于現有數據表明，這兩個位點中單一位點的(de)(de)缺失(shi)是極不可能的(de)(de)，提(ti)示方法學錯誤。強制擴展性缺(que)失分析(xi)使用異染色質位點(dian)sY160區分完全AZFc缺(que)失（b2/b4缺(que)失模(mo)式，sY160存在）和終(zhong)端缺(que)失（sY1160缺(que)失）。終端缺失以及b2/b4缺失可能(neng)與嵌(qian)合核(he)(he)型(xing)（46,XY/45,X）有關，因(yin)此，出于TESE預(yu)后原(yuan)因(yin)，也應要求進行核(he)(he)型(xing)分析。

如果實驗(yan)室(shi)決定檢測gr/gr部分AZFc缺失(shi)，可(ke)(ke)以通過使用(yong)兩個位點(dian)來實現(xian)：sY1291和sY1191；位點(dian)sY1291缺失(shi)和sY1191存在(zai)即可(ke)(ke)進(jin)行(xing)判斷(duan)。值得注意的是，一項多中心研究中檢測到5%的假缺失率，強調了優化PCR條件和額外驗證步驟的重要性。建(jian)議對亞洲患者進行Y單倍群(qun)分析(xi)，以(yi)排除不太可能影響精子發生的(de)Y譜系固定缺失。

6.3.4 檢測AZFbc缺失
sY127、sY134、sY254和(he)(he)sY255四個位點全部(bu)缺失提示AZFb和(he)(he)AZFc區域(yu)均完全缺失。更特異性的位點sY116可以用于(yu)確定AZFbc的缺失模(mo)式，如P4/P1遠端缺失，sY116存在，或P5/P1遠端缺失時sY116也缺失，該定義具有臨床預后價值。強(qiang)烈建(jian)議AZFbc缺(que)失時進(jin)行異(yi)染色質位點sY160檢測，以確定(ding)是否存在終(zhong)端缺(que)失。

6.4 PCR反應體系的建立：內部質量控制和推薦位點
臨床診斷中，基因組DNA的(de)PCR擴(kuo)增需要嚴(yan)格遵守良(liang)好的(de)實驗室(shi)規范和質(zhi)量控制的(de)基本原則，檢(jian)測時必須平行(xing)檢(jian)測陽(yang)性(xing)和陰性(xing)對照。AZF缺(que)失(shi)檢(jian)測(ce)時，應同步檢(jian)測(ce)陽性和陰性對(dui)照(zhao)，即一(yi)個精(jing)子發生正常(chang)的男(nan)性樣(yang)本和一(yi)個女性樣(yang)本。此外(wai)，需加入空白對(dui)照(zhao)——水(shui)樣(yang)（只(zhi)是用水(shui)代替(ti)模板DNA，包含除模版(ban)DNA外(wai)所有成分的PCR反應）。每一(yi)組PCR反應都至少采用兩管或(huo)更好(hao)的多重PCR進行。SRY基因是男性性別決(jue)定基因，位于Y染色體(ti)短臂，作為內對(dui)照，SRY基因可以在ZFY基因丟失時證明Y染色體特征序列的存在（比如：在XX男性中）。AZF診斷中另一個重要內對照是ZFX/ZFY基因(yin)，ZFX/ZFY檢測不僅與女性對照DNA相關，而且與SRY陰性的46,XX男性相關，是唯一的陽性標記。
原則上，在每個AZF區域中僅分析一個非多態性STS位點，就足以確定AZFa、AZFb或AZFc中是否存在缺失。然而，任何一個已知缺失區域都包括多個STS位點，分析每個區(qu)域中的2個STS位點可以提(ti)高診斷的準確性(xing)。因此，在檢測的第一步（基礎(chu)檢測分析）中(zhong)，每個(ge)AZF區域中(zhong)至少應(ying)分析2個(ge)STS位(wei)點。基于眾多實驗室經驗，外部質量控制結果，并考慮到多重PCR擴增的形式，以(yi)前版本指南中(zhong)推薦的(de)(de)STS引物的(de)(de)首選仍然有效。這(zhe)些引物包括：
AZFa：sY84*；sY86
AZFb：sY127；sY134
AZFc：sY254，sY255（均在DAZ基因中）

*更新了sY84-F和sY84-R的序列(lie)。根據最新測序數據，sY84-F引(yin)物序列中間位置存在錯(cuo)配(pei)，新指(zhi)南(nan)對引(yin)物序列進行了修正(zheng)。關于sY84-R，在(zai)亞(ya)洲(zhou)人群(qun)中檢(jian)測到引(yin)物序列第5核(he)苷(gan)酸位(wei)置(zhi)存在(zai)一(yi)個(ge)基因(yin)多態性SNP（rs72609647）。因(yin)此，如果該來源的(de)(de)樣本擴增失敗，應檢(jian)測sY84的(de)(de)替代引(yin)物和(he)/或sY84的(de)(de)替代鄰(lin)近位(wei)點。

對于(yu)強制擴展(zhan)性(xing)缺(que)失分(fen)析，推(tui)薦的引(yin)物為(wei)：
AZFa：近端斷點：sY82和sY1064；遠端斷點：sY1065（或sY1182）和sY88
AZFb：近端斷點：sY105和sY121/sY1224；遠端斷點：sY1192和sY153
AZ1Fc：sY160

總之，這兩(liang)種引物(wu)組的(de)使用(yong)足以用(yong)于(yu)常規診斷，能(neng)夠檢測幾乎所有臨床(chuang)相關(guan)的(de)AZF缺(que)失(shi)以及文獻(xian)中報(bao)道的(de)95%以上的(de)缺(que)失(shi)，同時為TESE提供足夠的(de)預(yu)后(hou)價值。強烈(lie)鼓勵所有實(shi)驗室采(cai)用這些位(wei)點，便于(yu)實(shi)驗室質量控制，并將檢測差異降至(zhi)最低。

6.5 檢測結果及重復檢測結果解釋
指南建議的方案都經過認真設計和優化，采用兩管多重PCR反應(ying)，每管多重PCR反應(ying)體系中都包括每個(ge)區域的一個(ge)位點。因此，當樣本(ben)中發生完全缺(que)失(shi)時，兩管PCR反應都(dou)應顯(xian)示該(gai)區域(yu)特異(yi)性(xing)位點缺(que)失(shi)。雖然如果相關區域僅一個位點缺失，AZFa和AZFb區域的部分缺失是可能的，但僅sY254或sY255（AZFc/DAZ）的選擇性(xing)單個位(wei)點(dian)缺失通常被(bei)視為方(fang)法學錯誤(wu)。如果(guo)只有(you)一個(ge)(ge)AZFa或AZFb位(wei)點(dian)缺失(shi)，則首先(xian)必須仔細求證該缺失(shi)情況(kuang)，然后對(dui)整個(ge)(ge)區域進行更(geng)詳細的研(yan)究。如果(guo)AZFabc缺失(shi)（所有(you)8個(ge)(ge)Yq位(wei)點(dian)都(dou)缺失(shi)），則對(dui)照位(wei)點(dian)（SRY和ZFX/ZFY）的解釋非常重要，以(yi)排除技術問題。
每個實驗室應根據可用的設備和試劑（如PCR儀和DNA聚合酶的類型）以及DNA質量/數量/來源，仔細優化PCR反應條件。如(ru)果結果不明確和/或懷疑存在技術故障，則應(ying)重復進行(xing)多重反應(ying)。如果多重反應對特定的DNA樣本不起作用，則可以在單管反應中運行引物組。如果兩個多重PCR的結果一致支持缺失，則該缺失被確認。如果兩個多重PCR檢測的結果不一致，則應在單管PCR中重復整套引物。單管PCR不易發生擴增失敗，強烈建議(yi)在(zai)較低的(de)退火溫度下重復反應(ying)。為避(bi)免擴增失敗，應極力避(bi)免相(xiang)同(tong)引(yin)物的重(zhong)復凍融。關于反應重(zhong)復次數(shu)，沒有一般性(xing)建議，應直到結果清(qing)晰和可重(zhong)復（良好(hao)的實驗室建議）。

七、遺傳學檢測結果報告

報告應以標準化格式編寫，并應對非專業人員清晰友好。一般來說，報告必須清楚、簡明、準確和易于解釋，不可以接受手寫的報告。報(bao)告必須包括(kuo)以(yi)下一般(ban)信息：

 送檢患者的醫生身份
 檢測和出具報告實驗室的清晰和完整的身份識別（包括唯一的實驗室編號/識別號碼）
 標題
 送檢和報告日期
 患者信息：完整姓名、姓氏、出生日期和生理性別
 樣本類型（如血液、口腔涂片等）
 非專業人員可以理解的書面解釋和結論
 （至少）兩名獨立評估人員的簽名（包括他們的職責）
 頁碼
 如果報告(gao)超(chao)過一頁，頁碼應(ying)該清晰（如第X頁/共(gong)Y頁），每頁都應(ying)有(you)患者身份標識

還必須包括以下具體信息：
 以某種形式重述送檢的原因（如，對Y染色體微缺失的診斷）和適應癥（如，無精子癥、ICSI準備、pre-TESE等）。
 所用方法（如多重PCR擴增），包括檢測方法的局限性；如果使用了市售的試劑盒，則必須披露其名稱、制造商和批號。
 如果檢測/分析外包給外部實驗室或公司，必須清楚地說明這些信息。
 分析結(jie)果(guo)：必須(xu)報(bao)告被檢測位(wei)點(dian)的結(jie)果(guo)。最好(hao)利(li)用表格列出(chu)所(suo)有支持(chi)解釋(shi)(shi)的STS位(wei)點(dian)結(jie)果(guo)（注意：如果(guo)使用了包含大量位(wei)點(dian)的試劑盒，建議(yi)在報(bao)告中只列出(chu)與解釋(shi)(shi)相關的位(wei)點(dian)結(jie)果(guo)）。避免使用+和-，這可能會造成(cheng)誤解，用單詞代替(ti)（例如，present/absent，或類似的）。

7.1 Y微缺失檢測的替代方法
自1999年第一份指南發表以來，已經開發了多種評估Y染色體缺失的替代方法。此外，還提供了各種商業試劑盒。然而，這些往往包含不必要的大量位點，并由此混淆分析，最終導致“假性”缺失的診斷結果，尤其是在DNA質量和/或PCR條件不理想的情況下。此外，大多數試劑盒不能(neng)通過單管PCR對疑似(si)缺失進行驗證。基于基因特異性位點的多重PCR方法允許檢測孤立的基因特異性缺失，但這些缺失的臨床意義極端罕見和不明確，阻礙了其在常規診斷中的應用。此外，這些試劑盒中包含基因特異性位點，需對結果進行特別仔細的解釋，并在可能的情況下驗證可疑的單基因缺失。
已公布的(de)替代方法，部(bu)(bu)分基(ji)于指南(nan)，部(bu)(bu)分則沒有，主要包括(kuo)毛細(xi)管電泳、real-time PCR、MLPA、aCGH或下一代測(ce)序（NGS）。real-time PCR的優點是相對快速，不涉及凝膠電泳，但所需的設備比標準方法更不容易獲得。AZF區(qu)域的特殊(shu)結構及其在不同人群中的顯著(zhu)差異對廣泛實施基(ji)于(yu)NGS的方(fang)法提出了重大(da)挑(tiao)戰。這些挑戰可能導致(zhi)診(zhen)斷錯誤，并強烈(lie)建議在(zai)沒(mei)有適當驗證和Y染色體分析的廣泛(fan)專(zhuan)業知識的診(zhen)斷條件下考慮使(shi)用(yong)基于NGS的方法時要謹慎。隨著這項技術的可用性和正確實施變得越來越普遍，它可能(neng)會帶(dai)來新的(de)、更全面的(de)檢測，從(cong)而進一步(bu)提高無精子癥男(nan)性(xing)的(de)診斷(duan)率。

總之，在以前(qian)版本的(de)(de)指南中建(jian)立的(de)(de)兩步多重(zhong)PCR仍然是進行Y染(ran)色體(ti)缺失檢(jian)測的(de)(de)最具成本效益(yi)、可重(zhong)復性和最容易獲得的(de)(de)方法(fa)。如果實驗室決定建立替代方法，則需(xu)要在(zai)適當數量的樣本上驗證新(xin)方法，包括陽性和陰性對照，以評估檢測(ce)的特(te)異性和敏感性。無論何時采用替代方法，報(bao)告都應(ying)明確包括所(suo)使用的確切實驗設計，而不是(shi)將其稱為(wei)“根據指(zhi)南”。后者僅(jin)適用于本文所述的兩步(bu)多重PCR+強制擴展性缺失分析。

八、EAA/EMQN外部質量評估22年經驗

強(qiang)烈建議進(jin)行AZF檢測(ce)的實(shi)驗(yan)室加入(ru)年(nian)度“EQA計劃”。該計劃每年向參與實驗室分發三份具有模擬臨床病例特征的、經驗證的DNA樣本，處理方式與患者樣本的處理方法完全相同，包括報告。實驗室結(jie)果由至少兩名(ming)獨(du)立評審員進行評估。從2000年(nian)至2012年(nian)，參與(yu)該(gai)計(ji)劃的實驗室(shi)數量幾乎增加(jia)了兩倍，從57個增加(jia)到(dao)148個（圖3A），這(zhe)一數字(zi)在過去10年(nian)中一直保持穩(wen)定。診斷錯誤率也急劇下降，從該項(xiang)目開(kai)始前5年的近8%下降到目前的1%-2%（圖3B）。參(can)與評估的診(zhen)斷報告質量和結果解(jie)釋顯著提高(gao)，在過(guo)去4年中，超過(guo)70%的分析報告獲得滿(man)分。值得注意的是，不必要的大量位點(dian)檢測——通常是(shi)商用(yong)試劑盒(he)的一部分——仍然是(shi)解釋錯誤的主要來(lai)源。總之，這一(yi)既(ji)定的(de)(de)EAA/EMQN AZF方案已經證明，它是提(ti)高參與(yu)實驗室績(ji)效的(de)(de)一(yi)個有價值的(de)(de)工具，建議進行AZF檢測的(de)(de)實驗室都加入該年度計(ji)劃。

圖3 EAA/EMQN外部質量控制方案在評估實驗室績效方面的22年經驗結果

參考文獻：

[1] Krausz C, Navarro-Costa P, Wilke M, Tüttelmann F. EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions: State of the art 2023. Andrology. 2023;1-18. //doi.org/10.1111/andr.13514