摘要：Y染色體無精子癥因子（AZF）缺失檢測是診斷無精子癥和嚴重少精子癥的關鍵技術。作為2013年EAA/EMQN指南的修訂版，新版指南在回顧總結以往臨床相關進展的基礎上，對舊版指南內容進行了大量更新，并對EAA/EMQN提供的外部質量評估項目結果做出了反饋。基礎(chu)多(duo)重PCR檢測(ce)體系(xi)結合擴(kuo)展性(xing)缺(que)失分析(xi)，仍然是目前檢測(ce)和正(zheng)確解釋AZF缺(que)失的(de)金標準。同時，對sY84引物序列進行了更新，且對AZFa和AZFb缺失斷點的可互換邊界位點也進行了改進。具體而言，新版(ban)指南不再推薦sY83和sY143被(bei)用于擴(kuo)展(zhan)性缺(que)失分析(xi)，而是將(jiang)sY1064和sY1192作為首選位點。盡管目前有些國家AZF缺失檢測正在向注冊試劑盒化過渡，但應注意的是，許多商業產品由于包含大量不必要位點而不被推薦使用。此外，目前這些可用產品都不符合(he)用于擴展性缺失分(fen)析的新首選位點。AZFc區域gr/gr部分缺失是精子發生障礙人群特異性危險因素，也是睪丸生殖細胞腫瘤的易感因素。但這種缺失類(lei)型的檢(jian)測與否仍需由診斷實驗室和送(song)檢(jian)臨床醫(yi)生自行決定。鑒于EMQN/EAA計劃運行22年的經驗表明，參與計劃的實驗室基因型診斷錯誤率大幅下降，診斷報告質量也極大改善，強烈(lie)鼓勵AZF檢測實(shi)驗室(shi)每年參與(yu)該外部質量控制計劃。

 

Y染色體無精子癥因子（azoospermia factor，AZF）缺失是導致男性不育的第二大遺傳因素，其發生率僅次于克氏綜合征。在普通人群中，約每4000名男性中就有1人存在Y染色體微缺失，而在不育男性中其發生率更高。不同實驗室AZF微(wei)缺失(shi)發生率為2%~10%（甚至(zhi)更高），主要由研究人群組成差異導致。通常，接受外部機構送檢的常規診斷實驗室在沒有控制患者選擇的情況下的發病率要低得多，通常低(di)于2%。
已發表數據和質量(liang)控制計劃都證實，不同(tong)實驗(yan)室采取的檢測方案(an)差(cha)異，確實會導致不準確或(huo)完全錯誤的診斷，表明檢測標準化(hua)和質量(liang)控制的必要性(xing)。也因此(ci)，歐洲(zhou)男科(ke)學(xue)會（EAA）和分(fen)子(zi)遺傳(chuan)質量(liang)協作網（EMQN CIC）聯合開始(shi)提供外部質量(liang)評估(gu)（EQA）計劃，并定期發布(bu)Y染色體微缺失分(fen)子(zi)診斷的實驗(yan)室指南(nan)。

經10年(nian)數據積累，本次EAA/EMQN關于Y染色體(ti)AZF微缺失分子診斷指南作(zuo)出了大量(liang)更(geng)新(xin)，以更(geng)好服務(wu)于臨床。更(geng)新(xin)要點：
01 AZFa近端邊界位(wei)點(dian)sY83和sY1064不可互換，因為它們的結果取決于檢測到的AZFa完全缺失近端斷點的變化。重要的是，AZFa完(wan)全缺失可(ke)以與sY83（present）和(he)sY1064（absent）兼容。因此，在強(qiang)制擴展性缺(que)失分析中(zhong)只推(tui)薦sY1064，而不推(tui)薦sY83。
02 AZFb遠端邊界位點(dian)sY143和sY1192不能互換(huan)，只有(you)sY1192能夠區分AZFb完全和部分缺(que)失（從而為TESE成功與(yu)否提供可靠(kao)預后）。因此，在(zai)強制(zhi)擴展性缺失(shi)分析(xi)中(zhong)只推薦sY1192，而不推薦sY143。
03 對sY84的正向引物(wu)和反向引物(wu)序列進(jin)行了(le)更新，以避免正向引物錯配，同時反向引物兼容亞洲人群的SNP。
04 AZFb缺失斷點的可變性可導致大量AZFb和AZFbc完全缺失中sY1224近端邊界位點的保留。盡管這種變異的表型尚不清楚，但建(jian)議優先使用(yong)(yong)sY121，再使用(yong)(yong)sY1224（如果sY121缺失）。
05 據目前所知，擴展性缺失分析中首選位點的變化(hua)與目前市面上任何AZF缺失(shi)分子(zi)診斷試劑盒都不完全兼(jian)容(rong)。

 

一、Y染色體微缺失遺傳學檢測的適應癥

AZF缺失(shi)檢測(ce)的精液評估(gu)閾值尚未達(da)成共識(shi)。精子濃度<2×106/mL的無精癥或嚴重少精癥患者一般能夠發現臨床相關的缺失，而精子濃度在2~5×106/mL之間的不育患者很少有此發現。2010版《WHO人類精液檢查和處理實驗室手冊》將生精指標改為精子總數，歐洲臨(lin)床指南現今(jin)仍然將AZF缺失檢測(ce)的精子(zi)總數閾值設定為(wei)＜500萬(wan)精子(zi)/mL；然而，在精子(zi)濃度(du)>1×106/mL的男性中，該檢測(ce)的成本效益(yi)受到質(zhi)疑。但無論如何，一致建議對(dui)無精子癥男性進(jin)行Y染(ran)色(se)體缺失篩查(cha)，因為它不僅可以提供病因診斷，而且可以對(dui)TESE的成功(gong)率進(jin)行可靠(kao)估計。

圖1為本指南建議的分析步驟流程圖，分為基礎檢測體系和擴展性檢測體系。常(chang)規臨床參數，如激素(su)水平、睪丸(wan)體積(ji)、精索(suo)靜脈曲(qu)張(zhang)、睪丸(wan)發育(yu)不良、感染等(deng)，沒有任何預測價值(zhi)。通常，染(ran)色體異常(chang)（46,XY/45,X核(he)型除(chu)外）、梗阻性無精子癥（除(chu)非FSH高于正常(chang)限值）或促性腺功能減退癥患(huan)者不(bu)需要(yao)進行Y染(ran)色體分子分析。然而，在非特發(fa)性不育男性中已(yi)經(jing)發(fa)現了許多缺失攜帶(dai)者，即患有睪丸腫瘤、附睪閉塞、睪丸炎、精索靜脈曲張或化療/放療后的患者。因此，任何伴有(you)無(wu)精子癥(zheng)或嚴重少精癥(zheng)的診斷都(dou)應(ying)該是AZF檢(jian)測的指征。例如，對屬于上述精液類別的男性，在精索靜脈曲張切除術前進行AZF篩查很重要，因為缺失攜帶者很可能不會從手術中受益。Klinefelter患者檢測(ce)Y染色體缺失的臨(lin)床(chuang)實(shi)用性尚未確定。

圖1（A）AZF基礎檢測體系及診斷流程

 

 

圖1（B）AZF擴展性缺失檢測體系及診斷流程

 

 

二、Y染色體(ti)男性(xing)特異性(xing)區域結構

Y染色體男性特異性區域（MSY）參考序列包含156個轉錄單位（其中包括78個蛋白質編碼基因，編碼27種不同的蛋白質），分為三種類型：X-退化區（X-degenerate；來自染色體祖先狀態的單拷貝基因或假基因）、X-換位區（X-transposed；從X染色體獲得，與相應的X區域99%同源）以及擴增區（ampliconic）。其中，后者對應于重復區，分為多個家族類型，每個重復區在家族內重復之間共享幾乎完全（>99.9%）的同一性。擴增區包含9個睪丸特異性或富集表達的蛋白質編碼基因家族。最初，這些家族估計至少有60個編碼基因，現(xian)在這個數字已(yi)經增加到超過100個。由于擴增區的高度重復性，既可以進行基因轉換，也可以進行非等位基因（染色體內）同源重組（NAHR）。擴增子可以沿著MSY以有序的方式排列，從而形成回文：在MSY的相當長范圍內延伸的不同擴增子重復的鏡像塊。擴增子（和回文）組織增強了結構變異的產生，如缺失、重復和倒位。普遍認為，NAHR是產生AZF完全缺失的主要驅動力。這些交換發(fa)生在具有相同反向高度(du)同源重復序列(lie)之間，導致它(ta)們之間遺傳物質的(de)丟失（以(yi)及姐妹染(ran)色單體中的(de)相互重復）。考慮到MSY的高度重復性體系結構，已經確定了許多不同的MSY重排。只有明(ming)確(que)確(que)定與男性(xing)不育相關的才是本指南的重點。

 

三、Y染色體缺失類型及其分子機制

圖2 Y染色體示意圖和臨床相關微缺失模式

 

本指南依舊沿用經典Y染色體微缺失區域的定義模式，分為：AZFa區缺失、AZFb區缺失、AZFbc區缺失和AZFc區缺失。

 AZFa區域：長792kb，包含單拷貝基因USP9Y（原DFFRY）和DDX3Y（原DBY）。第三個基因，UTY，功能未知，定位于該區遠端。AZFa完全缺失的起源可追溯到HERVyq1和HERVyq2逆轉錄病毒序列中同向的相同序列塊之間的NAHR。重組可發生在這些逆轉錄病毒序列（ID1和ID2）中兩個相同序列塊中的一個，導致至少兩種略有不同的缺失模式。無論如何，AZFa完全缺失都丟失了約792kb，包含USP9Y和DDX3Y缺失(shi)。

 AZFb和AZFc這兩個區域共包含24個不同的基因，其中大多數存在于多個拷貝中。AZFb完全缺失刪除了6.2Mb（包括32個轉錄單位），并且是由P5/近端P1回文之間的NAHR引起。因此，AZFb完全缺(que)失也(ye)可(ke)以(yi)稱為P5/近端P1缺(que)失。AZFc區包括12個基因，每個基因以可變拷貝數存在，總共32個轉錄單元。AZFc完全缺失去除3.5Mb（共21個轉錄單元，其中10個被認為是蛋白質編碼），并分別源自回文P3和P1中b2和b4擴增子之間的NAHR。類似于AZFb缺失，AZFc完全缺(que)失(shi)也可(ke)以(yi)基于(yu)NAHR事件(jian)的干預靶(ba)點（即b2/b4缺(que)失(shi)）來參考。

 AZFb和AZFc區域的異常重復增加了額外重排的發生，這些重排也可能與它們對精子發生的影響有關。一些對應于幾乎全部去除AZFb和AZFc區域的缺失模式。這些AZFbc缺失是通過兩種主要機制發生的，涉及P5/遠端P1之間（7.7Mb，丟失42個轉錄單位）或P4/遠端P1之間（7.0Mb，失去38個轉錄單位）的NAHR。此外，AZFc區域內(nei)較少(shao)的缺(que)失（部分缺(que)失）也會限制精子發生，這些是本指南重點。

綜(zong)上所述，以下復(fu)發性(xing)Y染色(se)體完全微(wei)缺失具有臨床相關性(xing)，是無精(jing)子癥或嚴重少精(jing)癥男(nan)性(xing)生精(jing)障礙(ai)的原因（圖2）：
—AZFa
—AZFb（P5/近端P1）
—AZFc（b2/b4）
—AZFbc（P5/遠(yuan)端P1或P4/遠(yuan)端P1）

最常(chang)見的完全缺(que)(que)失(shi)類型是AZFc缺(que)(que)失(shi)（70%-80%），其次是AZFa缺(que)(que)失(shi)（0.5%-9%）、AZFb缺(que)(que)失(shi)（1%-7%）和AZFbc缺(que)(que)失(shi)（1%-20%）。AZFabc缺失最有可能與異常核型(xing)有關，如(ru)46,XX男性或(huo)iso(Y)。

 

 

四、AZF完全缺失的基因型-表型相關性

AZF缺(que)失(shi)與生精失(shi)敗特異性(xing)相(xiang)關。盡管已經報道了一些罕見的AZFc完全缺失自然傳播病例，但它們主要反映了這樣一個事實，即(ji)在特(te)殊條件(jian)下，精(jing)子數量非常低的男(nan)性可以進行自然受精(jing)。因此，將Y缺失視為無精子(zi)/少精子(zi)癥的原(yuan)因(yin)而不是(shi)“不育”的原(yuan)因(yin)更為合適。AZF缺失檢測具有預(yu)后價值，并可能影響治療選擇(ze)。應為所有符合TESE結合卵胞漿內單精子注射（TESE-ICSI）條件的無(wu)精子癥患(huan)者提供缺失篩查。

 AZFa區域完全缺失導致唯支持細胞綜合征（SCO）睪丸表型和無精子癥。AZFa區域(yu)完全缺失表明TESE-ICSI幾(ji)乎不可(ke)能取到睪丸(wan)精(jing)子(zi)。

 AZFb和AZFbc區域（P5/近端(duan)P1、P5/遠端(duan)P1、P4/遠端(duan)P1）完全缺失與無精子癥有關(guan)，大約一半的男性具有SCO睪丸表型，另一半表現為生精性阻滯（通常具有正常的FSH和正常的睪丸體積），從而阻止男性配子的成功產生。與AZFa完(wan)全缺(que)失(shi)類似，AZFb完(wan)全缺(que)失(shi)的男性也幾乎不可能通過TESE獲得(de)精(jing)子。然而，罕見(jian)的(de)非典型AZFb或AZFbc缺失也(ye)可嘗試(shi)利用(yong)TESE進行取精，這種缺失(shi)特(te)征為P4回文的近端斷點（而不是P5）。事實上，在P4處具有近端(duan)斷點的(de)較小缺失可(ke)能與額外的(de)AZFb基因拷貝(bei)的(de)保留(liu)有關，如XKRY、CDY2和(he)HSFY，因(yin)此導致(zhi)了TESE陽性結果(guo)的(de)可能。同樣，通(tong)過保留遠端sY1192位點（擴展(zhan)性缺失(shi)(shi)分(fen)析(xi)的一部(bu)分(fen)）確定的部(bu)分(fen)AZFb缺失(shi)(shi)也可以與殘(can)余精(jing)子兼(jian)容。強調區分(fen)完全（P5/近端P1）和部分(fen)AZFb缺失(shi)的(de)重要性。考慮到以上情況，新版指(zhi)南建議在強制擴展性(xing)缺失分析步驟中(zhong)，確定AZFb缺失的遠(yuan)端斷(duan)點(dian)時(shi)，將sY1192作為(wei)首選位點(dian)，而(er)不(bu)是(shi)sY143。需要強調的是，不僅遠端斷點，近端斷點也可以區分TESE陰性和TESE陽性患者。因此，執(zhi)行擴展性缺失分析是最重要的(de)，因為該(gai)信息將最終確定是否應該(gai)嘗試TESE。只有完(wan)整的檢(jian)測(ce)結果（包括基礎和擴展性缺(que)失(shi)位點(dian)）才能對AZFb缺(que)失(shi)男性的生殖選擇提(ti)供必要(yao)見解。在sY1192陰性P5/近端(duan)P1缺(que)失(shi)的情況下，不建議使(shi)用TESE，因為提取到精子的機會非常低/幾乎為零。然而，應該注意的是，可能由于遺傳背景效應，sY1192陰性的AZFb和AZFbc缺失與完(wan)全精子發(fa)生相(xiang)兼容的情(qing)況雖極為罕見，但也有發(fa)生。

 AZFc完全缺失（b2/b4）與無精子癥或嚴重少精子癥有關，對精子發生有強烈的有害影響。但與AZFa和AZFb相反，AZFc完全缺(que)失也有可能有殘留(liu)精(jing)子發生(sheng)。多項研究表明，與(yu)這種(zhong)缺失類(lei)型相(xiang)關的生精損傷表型會(hui)隨(sui)著時間的推移(yi)而(er)加重(zhong)，但也有研究未能復現這種影響。AZFc完全(quan)缺失患(huan)者通過TESE獲得精子的(de)幾(ji)率平(ping)均(jun)約為50%，但差異很大（從15%到71%），一方面是患者自身生物學上的差異，另一方面也說明了TESE技術方面的差異。根據現有數據，外周血中45%以(yi)上的(de)X細胞系(xi)可(ke)被(bei)認(ren)為是精子發生的(de)負(fu)面預測因(yin)素。

 

五、遺傳咨詢

5.1 遺傳咨詢

遺傳咨詢是強制性環節，以向患者提供有關妊娠精子發生受損男性后代風險的相關信息。

 AZFc缺失以及AZFa和AZFb部分缺失，因為其可遺傳性，需要對其男性(xing)家(jia)庭(ting)成(cheng)員進行遺傳咨詢。

 AZFa、AZFb和AZFabc的完全缺失通常沒有精子產生，因此不(bu)建議進行家族篩查，也不(bu)應(ying)在報告中(zhong)提及。

 非終端AZFbc缺失通常與非參考Y染色體相關，在一些非典型缺失病例中，盡管生精功能嚴重受損，但仍可能有精子發生。這類缺失將強制性地傳遞給其男(nan)性后代，因(yin)此，患者應被(bei)告知(zhi)妊娠精子發生受損男(nan)性后代的風險。

 

5.2 生殖策略

 如(ru)果精液(ye)或睪丸中存在精子，AZF缺(que)失患者可以自然受孕（在一些(xie)極罕(han)見的(de)(de)AZFc完(wan)全缺(que)失的(de)(de)病例中）或通過MAR受孕。AZFc完全缺失患者行ICSI的研究已有報道，個別研究發現缺失對關鍵MAR參數有負面影響，如受精率、胚胎質量和活產率下降，但大多數研究(jiu)沒有發(fa)現AZFc完全缺失與未缺失男性在(zai)受(shou)精率和(he)妊娠率方面(mian)存在(zai)任何顯著差異(yi)。因此，這種缺失是否對MAR結果(guo)有(you)任何顯著(zhu)(zhu)影響仍然是一個有(you)爭議(yi)的問題。近期一項基于(yu)12項研究的薈(hui)萃分析表(biao)明，與沒(mei)有(you)遺傳異(yi)常的患者（使用精(jing)液精(jing)子或睪丸(wan)精(jing)子）相比，缺失患者除受(shou)精(jing)率(lv)顯著(zhu)(zhu)下降外，其他生殖(zhi)結果(guo)（如(ru)胚胎(tai)質(zhi)量(liang)、臨床妊娠率(lv)、流產率(lv)和活產率(lv)）都沒(mei)有(you)變化。

 Y染(ran)色體微缺失的(de)傳播對(dui)后代健康(kang)的(de)潛在影響是一個激烈爭論的(de)問題。雖然(ran)(ran)父(fu)親(qin)的(de)(de)缺(que)失(shi)(shi)必(bi)然(ran)(ran)會遺傳(chuan)給男性(xing)后(hou)代(dai)(dai)，從而導(dao)致(zhi)子(zi)代(dai)(dai)精子(zi)發(fa)生(sheng)受(shou)損，但由于不(bu)同的(de)(de)遺傳(chuan)背(bei)景和(he)(he)不(bu)同環境因素對(dui)(dui)生(sheng)殖功(gong)能(neng)的(de)(de)影響(xiang)，確(que)切的(de)(de)睪丸表型(xing)無法預測。據報道，受(shou)Yq微缺(que)失(shi)(shi)影響(xiang)的(de)(de)父(fu)親(qin)經ICSI所(suo)生(sheng)嬰兒的(de)(de)數量仍然(ran)(ran)相對(dui)(dui)較低(di)，只有268例(li)有充分記錄(lu)。這(zhe)些兒童中(zhong)，除了(le)一(yi)名(ming)在出生(sheng)時患(huan)(huan)有肺動脈閉鎖(suo)和(he)(he)右心室發(fa)育不(bu)全以(yi)及一(yi)名(ming)患(huan)(huan)有非特(te)定“嚴(yan)重(zhong)畸形”外，表型(xing)似(si)乎(hu)都(dou)正常(chang)；而這(zhe)兩(liang)名(ming)兒童的(de)(de)父(fu)親(qin)都(dou)攜帶AZFc缺(que)失(shi)(shi)。人們對(dui)(dui)后(hou)代(dai)(dai)患(huan)(huan)特(te)納綜合征(zheng)（45,X）的(de)(de)潛在風險以(yi)及與性(xing)染色(se)體(ti)(ti)嵌(qian)合體(ti)(ti)相關(guan)的(de)(de)其他(ta)表型(xing)異常(chang)（包括生(sheng)殖器模(mo)糊）表示擔(dan)憂。關(guan)于患(huan)(huan)有Y微缺(que)失(shi)(shi)的(de)(de)男性(xing)和(he)(he)具有嵌(qian)合46,XY/45,X染色(se)體(ti)(ti)核(he)型(xing)和(he)(he)/或Turner患(huan)(huan)者數據表明，一(yi)些Yq微缺(que)失(shi)(shi)可(ke)能(neng)與整體(ti)(ti)Y染色(se)體(ti)(ti)不(bu)穩定有關(guan)，這(zhe)可(ke)能(neng)導(dao)致(zhi)45,X細胞系的(de)(de)形成(cheng)。在268例(li)報告的(de)(de)Yq缺(que)失(shi)(shi)父(fu)親(qin)所(suo)生(sheng)的(de)(de)ICSI嬰兒中(zhong)，沒有觀察到生(sheng)殖器模(mo)糊或特(te)納綜合征(zheng)。

 兩(liang)篇論文報道了對(dui)來自Y染色(se)體(ti)缺失攜帶者的胚胎(tai)進行植入前遺傳診斷，并提供了胚胎(tai)非(fei)整倍(bei)體(ti)率的數據。其中一項研究沒有發現性染色體異常，而另(ling)一項研(yan)究發現了更高比例的X單體胚胎。建議在(zai)與患(huan)者討論染色體異常的風(feng)險時(shi)要(yao)謹慎。此外，由于攜帶45,X染色體核型的胚胎有很高的自然流產風險，Yq缺失(shi)男性(xing)伴侶流(liu)產率可能更(geng)高(gao)。然而(er)，這種可(ke)能性還有待正式檢驗。

 沒有證據表明AZFc完全(quan)缺失與后代(dai)的智力、心(xin)理或運動(dong)發育障(zhang)礙有關。位于假常染色體區（PAR）的SHOX（矮小同源盒）基因的(de)(de)單倍(bei)體充足(zu)性的(de)(de)假(jia)定關聯在(zai)更(geng)大的(de)(de)多中(zhong)心(xin)研(yan)究(jiu)(jiu)中(zhong)沒有被復現(xian)，也沒有在(zai)智利人群(qun)的(de)(de)獨立(li)研(yan)究(jiu)(jiu)中(zhong)發(fa)(fa)現(xian)。后者僅在(zai)等臂染色體Yp和(he)/或Y缺(que)對相(xiang)關的(de)(de)終端AZFbc缺(que)失患者中(zhong)發(fa)(fa)現(xian)了PAR異常(chang)。這(zhe)項研(yan)究(jiu)(jiu)還報道了7名AZFbc終端缺(que)失和(he)核型異常(chang)患者中(zhong)的(de)(de)5名出(chu)現(xian)神經障礙(ai)。值得注意的(de)(de)是(shi)，這(zhe)一發(fa)(fa)現(xian)在(zai)更(geng)大的(de)(de)隊列中(zhong)的(de)(de)驗證仍有待確定。

總之，Y染色體微缺(que)失(shi)的分子(zi)診斷(duan)指征是基(ji)于嚴重(zhong)生精(jing)量減少(shao)(shao)，強烈建議無精(jing)子(zi)癥和嚴重(zhong)少(shao)(shao)精(jing)癥患者進行檢測。然(ran)而，需要AZF缺失檢測的嚴重少精(jing)癥(zheng)的閾值（1×106/mL至(zhi)5×106/mL精(jing)子濃度范(fan)圍(wei)內）仍存在爭議(yi)（見(jian)上(shang)文）。AZF檢測對精子提取具有預后價值，如果在精液或睪丸活檢中發現精子，則缺失將傳遞給男性后代。雖然數據存在異質性，但最新薈萃分析表明，除受精率外，Y染色體重排(pai)不會顯著(zhu)影(ying)響MAR結果(guo)。盡管在過去10年間，父親Y染色體缺失所生嬰兒的數量進一步增加，但仍然沒有關于特納綜合征、生殖器模糊或其他染色體異常的確切風險的明確信息。顯然，有必要針對Yq缺失的男性及其潛在后代制定強有力的后續計劃。AZFc完全(quan)缺失和AZFb或AZFa部分缺失時，應在實驗室報告中要求對該家族的男性(xing)成員進行分析。此外，AZFc完全缺(que)失(shi)或Yq終端缺(que)失(shi)時(shi)，建議進行廣泛的核型(xing)分析（計數100個中(zhong)期），以(yi)排除與結構(gou)異常的Y染(ran)色(se)體相關的46,XY/45,X嵌(qian)合體。

 

六、AZF部分缺失

6.1 AZFa區域基因特異性缺失
盡管一些研究發現單個AZF基因缺失的發生頻率非常高，但這些數據與一項包含2000多名患者的大樣本研究結果大相徑庭。所(suo)有(you)已確認的AZF基因特異性缺(que)(que)失(shi)（具有(you)明確的斷(duan)點）均位(wei)于(yu)AZFa區(qu)，其中5個(ge)特異性缺(que)(que)失(shi)部(bu)分或完全影(ying)響(xiang)USP9Y基因。基因特異性缺失均不是由NAHR引起的，其特異性導致此類事件極為罕見，而且AZFa部分缺失的相關表型異質性很大，從無精子癥到正常精子癥都可能發生，提(ti)示USP9Y是精(jing)子發(fa)生(sheng)過程中的精(jing)細調節因(yin)子，而(er)并不是決定性因(yin)子。此外，DDX3Y的功能缺失(shi)變異是(shi)無精(jing)子(zi)癥的病因，該基因也是(shi)AZFa區域的關鍵生精(jing)因子(zi)。

6.2 AZFc部分缺失——gr/gr缺失及其臨床意義
AZFc區域特別容易受到NAHR事件的影響，從而可能導致部分缺失和重復。其中，gr/gr缺(que)失(shi)(shi)是(shi)被研究得較為廣(guang)泛(fan)的(de)一種(zhong)，該缺(que)失(shi)(shi)可以造成AZFc區域近一半的(de)基因丟失(shi)(shi)（具有生殖細胞獨有或顯性表達的基因）。gr/gr缺失的表型(xing)高度可(ke)變，從無精癥(zheng)到正常精子量表現不一，對生精的影響依然存在爭議。且該缺失表型(xing)具有群(qun)體(ti)依賴性(xing)以及(ji)可(ke)能是TGCT的誘發(fa)因素，并可(ke)能在子代中擴展為AZFc區的完全缺失。因此，gr/gr缺(que)失是精子(zi)生成障(zhang)礙遺傳(chuan)分析風險因素的一個特例，其(qi)是否(fou)作為常規檢測(ce)尚(shang)未達成共識，需由診斷實驗室(shi)和送檢臨(lin)床醫生自(zi)行(xing)決定(ding)。

6.3 診斷指南
檢測AZF缺失的首(shou)選(xuan)方法是對Y染色(se)體的選(xuan)定區域進行(xing)PCR擴(kuo)增。已有(you)研究表明，與定位(wei)(wei)于非(fei)編碼區(qu)的(de)(de)(de)有(you)效(xiao)位(wei)(wei)點(dian)相比，使用基(ji)因特異性序(xu)列(lie)位(wei)(wei)點(dian)（STS）并(bing)沒有(you)提(ti)高臨床(chuang)相關微缺失的(de)(de)(de)檢測率。因此，從臨床(chuang)角(jiao)度來(lai)看，所選(xuan)位(wei)(wei)點(dian)是擴增(zeng)匿名區(qu)域還是擴增(zeng)特定的(de)(de)(de)MSY基(ji)因基(ji)本上并(bing)不重要。真(zhen)正至關重要的(de)(de)(de)是，所選(xuan)擇(ze)位(wei)(wei)點(dian)能(neng)夠(gou)顯(xian)示(shi)出一致(zhi)的(de)(de)(de)微缺失模式。

6.3.1 AZFa缺失檢測
AZFa區域(yu)的分子檢測使用兩個STS標(biao)記(ji)：sY84和sY86。兩者都位于USP9Y和DDX3Y基因上游。根據缺失的致病機制和現有數據，sY84和sY86同時缺失時，并不是100%的AZFa完全缺失，但其概率是非常高的，有可能（盡管很少）兩個位點都缺失而不影響AZFa的兩個基因，或只有USP9Y基因受到影響。因此，AZFa缺(que)失(shi)檢測需(xu)要進行(xing)強(qiang)制性的(de)擴展性缺(que)失(shi)分析，包括近端(duan)邊(bian)界(jie)sY82（present）/sY1064（absent）以及遠端(duan)邊(bian)界(jie)sY1065或sY1182（absent）/sY88（present）。近期數據表明，相當一部分AZFa完(wan)全缺(que)失病例中，近端斷點標記sY83（既往(wang)版本作為sY1064的(de)等效選(xuan)項）仍(reng)然(ran)存在。因此，為了避免將AZFa完全缺失誤診為部分缺失，強烈建議在擴展性缺失(shi)分析中(zhong)使用sY1064而不是sY83（或者(zhe)至少(shao)應該檢測sY1064，以證實在sY83陽(yang)性病例中(zhong)確實是完全(quan)缺失(shi)）。這兩個AZFa基因位于AZFa區域更遠端，因此檢測推(tui)薦(jian)遠端AZFa位點(dian)與TESE預后非(fei)常相關，且近端斷點(dian)的(de)確切位置（sY83存(cun)在或不(bu)存(cun)在）實際上并不(bu)影響對缺失的(de)臨床解釋。如(ru)果只發現sY84或sY86缺失（排除擴增(zeng)失敗），則(ze)應(ying)對AZFa區域進(jin)行更詳細的研究。然而，這(zhe)一事件目前被認(ren)為是非常罕見(jian)的。

6.3.2 AZFb缺失檢測
sY127和(he)sY134分別位于AZFb區域的中端和(he)遠端。根據現有數據，絕大多(duo)數情況下，兩個位(wei)點缺失(shi)即可表明AZFb區(qu)域(yu)完全缺失(shi)。但為了明確TESE的預后，需(xu)要使用(yong)額外位點進行強制擴展性缺失分析，所選(xuan)用(yong)位點包括：近端邊界的sY105（present）、sY121/sY1224（absent），以(yi)及遠端邊界的sY1192（absent）和(he)sY153（present）。需要注意的是，以前版本認為sY143或sY1192是可以等效的，但最近數據表明，sY1192（而不(bu)是sY143）對TESE預后有價值。此外，近期數據還表明，以前版本中(zhong)推薦的sY1224（相(xiang)當于sY121）在相(xiang)當數(shu)量的AZFb和(he)AZFbc完全缺失患者中(zhong)仍然(ran)存在。盡管這種變(bian)異的表型仍有待表征，但強烈(lie)鼓勵使用位點sY121和(he)sY1224（當(dang)sY121不存(cun)在時）。再次重申之前的建議，即反(fan)對檢測位點(dian)sY114和(he)sY152（仍包含在一些商業(ye)試劑盒中），因(yin)為它(ta)們定位于染(ran)色體上(shang)多個基因(yin)組區(qu)域中。特別地，sY152定位于DAZ基因，類似于sY255和sY254。在這方面，再次強調，根據sY152的假(jia)設缺失(shi)定義的所謂“AZFd”區域并不存在。盡管一(yi)些(xie)商業試劑盒(he)仍然包含這個假(jia)定區域(yu)，但(dan)強烈建議(yi)不(bu)要使用此類(lei)產(chan)品。

6.3.3 AZFc缺失檢測
位點(dian)sY254和sY255是DAZ基因的特異性標(biao)記位點(dian)，DAZ基因在Y染色體序列中以四個拷貝的形式存在，排列在兩個簇中。當sY254和(he)sY255同時(shi)缺失時(shi)，即(ji)可(ke)診斷AZFc區完(wan)全缺失。基于現有數據表明，這兩(liang)個位(wei)點中單一位(wei)點的缺(que)失是極不(bu)可能的，提示方(fang)法學(xue)錯誤。強制擴展性缺失(shi)分析使用異染色質位(wei)點sY160區分完全AZFc缺失(shi)（b2/b4缺失(shi)模式，sY160存在）和終端缺失(shi)（sY1160缺失(shi)）。終(zhong)端缺失以及b2/b4缺失可能(neng)與嵌(qian)合(he)核(he)型（46,XY/45,X）有關，因此，出于TESE預后原因，也應(ying)要求進行(xing)核(he)型分析。

如(ru)果實驗室決定(ding)檢測gr/gr部(bu)分AZFc缺失，可以(yi)通過使(shi)用兩個位(wei)點(dian)來實現：sY1291和sY1191；位(wei)點(dian)sY1291缺失和sY1191存在即可進行判(pan)斷。值得注意的是，一項多中心研究中檢測到5%的假缺失率，強調了優化PCR條件和額外驗證步驟的重要性。建議對亞洲(zhou)患者進(jin)行(xing)Y單倍群(qun)分析，以排除不太可能影響精子發生的Y譜系固定缺失。

6.3.4 檢測AZFbc缺失
sY127、sY134、sY254和sY255四個位點全部缺失提示AZFb和AZFc區域(yu)均(jun)完全缺失。更特異性的位點sY116可以用于(yu)確(que)定AZFbc的缺失模式，如P4/P1遠端缺失，sY116存在，或P5/P1遠端缺失時sY116也缺失，該定義具有臨床預后價值。強烈建議AZFbc缺失時進(jin)行異染色質位點sY160檢測，以確定(ding)是(shi)否存在終端缺失。

6.4 PCR反應體系的建立：內部質量控制和推薦位點
臨床診斷中，基因組DNA的(de)PCR擴增(zeng)需要嚴格遵(zun)守良好的(de)實驗室規(gui)范(fan)和質(zhi)量控制的(de)基本(ben)原則(ze)，檢(jian)測時必須(xu)平行(xing)檢(jian)測陽性(xing)和陰性(xing)對照。AZF缺(que)失(shi)檢測時，應(ying)(ying)同(tong)步檢測陽性(xing)(xing)和(he)陰性(xing)(xing)對照，即一(yi)個精子發生正常的(de)男性(xing)(xing)樣(yang)(yang)本(ben)和(he)一(yi)個女性(xing)(xing)樣(yang)(yang)本(ben)。此外(wai)，需加入(ru)空白對照——水樣(yang)(yang)（只(zhi)是用(yong)水代替模板(ban)DNA，包含(han)除模版DNA外(wai)所有成分的(de)PCR反應(ying)(ying)）。每一(yi)組(zu)PCR反應(ying)(ying)都至少采用(yong)兩管或更好的(de)多重(zhong)PCR進行。SRY基因是男(nan)性性別決定基因，位于Y染色體(ti)短(duan)臂，作(zuo)為內對照(zhao)，SRY基因可以在ZFY基因丟失時證明Y染色體特征序列的存在（比如：在XX男性中）。AZF診斷中另一個重要內對照是ZFX/ZFY基因，ZFX/ZFY檢測不僅與女性對照DNA相關，而且與SRY陰性的46,XX男性相關，是唯一的陽性標記。
原則上，在每個AZF區域中僅分析一個非多態性STS位點，就足以確定AZFa、AZFb或AZFc中是否存在缺失。然而，任何一個已知缺失區域都包括多個STS位點，分析每個(ge)區域中的2個(ge)STS位點可以提高診斷(duan)的準(zhun)確性。因此，在檢(jian)測的第一步（基礎檢(jian)測分析(xi)）中，每個(ge)AZF區域中至少應分析(xi)2個(ge)STS位點。基于眾多實驗室經驗，外部質量控制結果，并考慮到多重PCR擴增的形式，以(yi)前(qian)版(ban)本指南中推(tui)薦的STS引物的首選仍然有(you)效。這些(xie)引物包括：
AZFa：sY84*；sY86
AZFb：sY127；sY134
AZFc：sY254，sY255（均在DAZ基因中）

*更(geng)新(xin)了sY84-F和sY84-R的序列。根據最新測序數據，sY84-F引物序列(lie)中間(jian)位置存在(zai)錯配，新指南對(dui)引物序列(lie)進行了修正。關于sY84-R，在亞洲(zhou)人群中檢測到引(yin)物序列第5核苷酸位置存在一個(ge)基(ji)因多態性SNP（rs72609647）。因此，如果該來源的(de)樣(yang)本擴增(zeng)失敗，應檢測sY84的(de)替(ti)代(dai)引(yin)物和/或sY84的(de)替(ti)代(dai)鄰近(jin)位點。

對于強制擴展(zhan)性缺失分析，推薦(jian)的引物為：
AZFa：近端斷點：sY82和sY1064；遠端斷點：sY1065（或sY1182）和sY88
AZFb：近端斷點：sY105和sY121/sY1224；遠端斷點：sY1192和sY153
AZ1Fc：sY160

總之，這兩種引物(wu)組的(de)使(shi)用(yong)足(zu)以用(yong)于(yu)常規診斷，能(neng)夠檢測幾乎所有臨床相關的(de)AZF缺失以及(ji)文(wen)獻(xian)中(zhong)報道的(de)95%以上的(de)缺失，同時(shi)為TESE提供足(zu)夠的(de)預后(hou)價值。強(qiang)烈鼓勵(li)所有(you)實驗(yan)室(shi)采(cai)用這些位點，便于實驗(yan)室(shi)質量(liang)控制，并將檢測(ce)差異降至(zhi)最低。

6.5 檢測結果及重復檢測結果解釋
指南建議的方案都經過認真設計和優化，采用兩管(guan)(guan)多重PCR反應，每(mei)(mei)管(guan)(guan)多重PCR反應體系中都(dou)包括(kuo)每(mei)(mei)個區(qu)域的一個位點。因此，當樣本中(zhong)發生完全缺失時(shi)，兩(liang)管PCR反(fan)應都應顯示該(gai)區域特(te)異性位點缺失。雖然如果相關區域僅一個位點缺失，AZFa和AZFb區域的部分缺失是可能的，但僅sY254或sY255（AZFc/DAZ）的選擇性單(dan)個(ge)位點缺失通常被(bei)視為方法學錯誤。如果只有(you)(you)一(yi)個(ge)AZFa或AZFb位(wei)點缺(que)失(shi)(shi)，則首先必須仔細求證該(gai)缺(que)失(shi)(shi)情況(kuang)，然(ran)后對(dui)整個(ge)區域進行更詳(xiang)細的研究。如果AZFabc缺(que)失(shi)(shi)（所有(you)(you)8個(ge)Yq位(wei)點都缺(que)失(shi)(shi)），則對(dui)照位(wei)點（SRY和ZFX/ZFY）的解釋非常重要，以排除(chu)技術問題。
每個實驗室應根據可用的設備和試劑（如PCR儀和DNA聚合酶的類型）以及DNA質量/數量/來源，仔細優化PCR反應條件。如果結果不明確(que)和/或懷(huai)疑存在技(ji)術故障，則應重復(fu)進行多重反應。如果多重反應對特定的DNA樣本不起作用，則可以在單管反應中運行引物組。如果兩個多重PCR的結果一致支持缺失，則該缺失被確認。如果兩個多重PCR檢測的結果不一致，則應在單管PCR中重復整套引物。單管PCR不易發生擴增失敗，強烈(lie)建議在較低的退火溫度下(xia)重復反(fan)應。為避免(mian)擴增失敗，應(ying)極力(li)避免(mian)相同(tong)引物的(de)重(zhong)復(fu)凍融。關于反應(ying)重(zhong)復(fu)次(ci)數，沒(mei)有一般性建(jian)議(yi)，應(ying)直到結果(guo)清晰和(he)可(ke)重(zhong)復(fu)（良好(hao)的(de)實驗(yan)室建(jian)議(yi)）。

 

七、遺傳學檢測結果報告

報告應以標準化格式編寫，并應對非專業人員清晰友好。一般來說，報告必須清楚、簡明、準確和易于解釋，不可以接受手寫的報告。報告必(bi)須包(bao)括以下一(yi)般信(xin)息：

 送檢患者的醫生身份
 檢測和出具報告實驗室的清晰和完整的身份識別（包括唯一的實驗室編號/識別號碼）
 標題
 送檢和報告日期
 患者信息：完整姓名、姓氏、出生日期和生理性別
 樣本類型（如血液、口腔涂片等）
 非專業人員可以理解的書面解釋和結論
 （至少）兩名獨立評估人員的簽名（包括他們的職責）
 頁碼
 如(ru)果報(bao)告超過一頁(ye)，頁(ye)碼(ma)應(ying)該清(qing)晰（如(ru)第(di)X頁(ye)/共(gong)Y頁(ye)），每頁(ye)都應(ying)有患者(zhe)身份標識(shi)

還必須包括以下具體信息：
 以某種形式重述送檢的原因（如，對Y染色體微缺失的診斷）和適應癥（如，無精子癥、ICSI準備、pre-TESE等）。
 所用方法（如多重PCR擴增），包括檢測方法的局限性；如果使用了市售的試劑盒，則必須披露其名稱、制造商和批號。
 如果檢測/分析外包給外部實驗室或公司，必須清楚地說明這些信息。
 分析結果：必須報(bao)告(gao)被檢測(ce)位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)的(de)結果。最好利用表格列(lie)出(chu)所(suo)有支(zhi)持解釋的(de)STS位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)結果（注意：如果使(shi)用了(le)包含大量位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)的(de)試(shi)劑(ji)盒，建議在(zai)報(bao)告(gao)中(zhong)只(zhi)列(lie)出(chu)與解釋相關的(de)位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)結果）。避免(mian)使(shi)用+和-，這可能(neng)會造成誤解，用單詞(ci)代(dai)替（例如，present/absent，或(huo)類似(si)的(de)）。

7.1 Y微缺失檢測的替代方法
自1999年第一份指南發表以來，已經開發了多種評估Y染色體缺失的替代方法。此外，還提供了各種商業試劑盒。然而，這些往往包含不必要的大量位點，并由此混淆分析，最終導致“假性”缺失的診斷結果，尤其是在DNA質量和/或PCR條件不理想的情況下。此外，大多(duo)數試(shi)劑盒(he)不能通過單管(guan)PCR對疑似缺失進(jin)行驗(yan)證。基于基因特異性位點的多重PCR方法允許檢測孤立的基因特異性缺失，但這些缺失的臨床意義極端罕見和不明確，阻礙了其在常規診斷中的應用。此外，這些試劑盒中包含基因特異性位點，需對結果進行特別仔細的解釋，并在可能的情況下驗證可疑的單基因缺失。
已公(gong)布的替代(dai)(dai)方(fang)法(fa)，部分(fen)基于指南，部分(fen)則沒有，主要包括毛(mao)細(xi)管電(dian)泳、real-time PCR、MLPA、aCGH或(huo)下一代(dai)(dai)測序(xu)（NGS）。real-time PCR的優點是相對快速，不涉及凝膠電泳，但所需的設備比標準方法更不容易獲得。AZF區域的(de)特殊結構及(ji)其在不同人群中的(de)顯(xian)著(zhu)差異對廣泛實(shi)施基(ji)于NGS的(de)方法提出了重大挑戰。這些(xie)挑戰可能導致診斷(duan)(duan)錯誤，并強烈建議在沒有適當(dang)驗(yan)證和Y染(ran)色(se)體分析的(de)(de)廣泛專業知識的(de)(de)診斷(duan)(duan)條件下考慮使(shi)用基(ji)于NGS的(de)(de)方法時要謹慎(shen)。隨著這項技術的可用性和正確實施變得越來越普遍，它(ta)可能會帶來(lai)新的、更全面的檢測(ce)，從而(er)進一步(bu)提高無精(jing)子(zi)癥男性(xing)的診斷(duan)率。

總之，在以(yi)前版本的指南中建立的兩步多重PCR仍然是進行Y染(ran)色體(ti)缺失檢測的最(zui)(zui)具成本效益、可重復性和最(zui)(zui)容(rong)易獲得(de)的方法。如果實驗室決定建立替代方法，則需要(yao)在適當數量的樣本上(shang)驗(yan)證新方法，包括(kuo)陽(yang)性和(he)陰性對照，以評估檢測的特異(yi)性和(he)敏感性。無論何時采用替代方法，報告都(dou)應明確包括(kuo)所(suo)使用的確切實驗設計，而不是將其(qi)稱為“根據指(zhi)南”。后者僅適用于本文所(suo)述的兩步(bu)多重PCR+強制擴展性缺失分析(xi)。

 

八、EAA/EMQN外部質量評估22年經驗

強烈建議進行AZF檢(jian)測的實驗(yan)室加入年度“EQA計劃”。該計劃每年向參與實驗室分發三份具有模擬臨床病例特征的、經驗證的DNA樣本，處理方式與患者樣本的處理方法完全相同，包括報告。實驗(yan)室結果由(you)至少兩(liang)名獨立評(ping)審員進行評(ping)估。從2000年至(zhi)2012年，參與該計劃的實(shi)驗室數量幾乎增加(jia)了(le)兩倍(bei)，從57個(ge)增加(jia)到148個(ge)（圖3A），這一數字(zi)在過去10年中一直保(bao)持(chi)穩(wen)定。診斷錯誤率也急劇下降，從該項目開始(shi)前(qian)5年的近8%下降到目前(qian)的1%-2%（圖3B）。參與(yu)評估的診斷報(bao)告(gao)質量(liang)和結果解釋顯著提高，在(zai)過(guo)去4年中(zhong)，超過(guo)70%的分析報(bao)告(gao)獲得滿分。值得注意的是，不必要(yao)的(de)大(da)量位(wei)點檢測——通常是商用試劑盒(he)的(de)一部分——仍(reng)然是解(jie)釋錯誤的(de)主要(yao)來源。總之，這一(yi)既定的EAA/EMQN AZF方案已經(jing)證明，它是(shi)提高參與實驗室績效的一(yi)個有價值的工具，建議進行AZF檢測的實驗室都加入該年度計劃。

圖3 EAA/EMQN外部質量控制方案在評估實驗室績效方面的22年經驗結果

 

 

參考文獻：

[1] Krausz C, Navarro-Costa P, Wilke M, Tüttelmann F. EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions: State of the art 2023. Andrology. 2023;1-18. //doi.org/10.1111/andr.13514